红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用与机制研究

白生菊， 莫荣纤，魏锁成 *

西北民族大学 生命科学院工程学院 甘肃 兰州 730000

[摘 要]：为了探究红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的生长作用并阐明其作用机制。本实验选取浓度为4、8、16、30和40 μmol/mL的红景天苷，依次为SAL-1、SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5组，设对照组（CG）不加药。体外培养卵巢癌细胞SKOV3，CCK-8法检测SKOV3细胞增值的抑制率，qRT-PCR法检测SKOV3细胞PTEN mRNA的表达，Western-blot法检测各实验组PTEN蛋白的表达水平。结果显示，随着红景天苷浓度增加和作用时间延长，SKOV3细胞的抑制率随之增高，红景天苷显著促进SKOV3细胞PTEN mRNA和蛋白的表达。结果表明，红景天苷剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞SKOV3的增值，显著促进SKOV3细胞PTEN mRNA和蛋白的表达。红景天苷可能是通过调节PTEN mRNA和蛋白的表达水平发挥其作用。

[关键词]：红景天苷；卵巢癌细胞；PTEN

妇科肿瘤是导致女性死亡的重要原因。子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌是三大妇科常见癌症。我国每年可确诊5万左右的卵巢癌患者，死亡数2万左右^[1]。上皮性卵巢癌在卵巢癌中死亡率最高，在美国其占所有病例的90%^[2]。卵巢癌的发生过程隐匿，70%患者确诊时已到晚期，其5年生存率达不到30%^[3]，病死率在妇科恶性肿瘤中占第一位。

PTEN是一种同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌因子。20%的透明细胞癌和15%左右的卵巢子宫内膜样腺癌中可发现PTEN基因的缺失^[4、5]。PTEN与PI3K之间进行负反馈调节，PI3K的激活或PTEN缺失都可导致AKT的激活，促使肿瘤的发生发展，因此PTEN是通过参与PI3K/AKT信号通路发挥抑癌作用^[6]。

红景天苷是从红景天等红景天属中提取的一种酚类活性物质。近年来，多项研究表明红景天苷具有抗肿瘤的作用，可阻滞癌细胞的周期，诱导癌细胞的凋亡、分化和自噬，在多种癌症中均发挥着治疗的作用，抗癌靶点广泛^[7]。

本研究采用不同浓度的红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3，探究红景天苷对卵

巢癌细胞SKOV3的生长作用及其作用机制，有望为红景天苷抗肿瘤作用的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1实验材料

人卵巢癌细胞株SKOV3和McCoy^，s 5A培养基购买于上海酶研生物科技有限公司；胎牛血清购买于美国BI公司；红景天苷购买于成都瑞芬思生物科技有限公司，细胞增殖-毒性检测试剂盒购买于北仁化学科技（上海）有限公司；qRT-PCR相关试剂购买于生工生物工程股份有限公司；Western-blot相关试剂购买于博士德生物科技有限公司。

红景天苷溶解于McCoy^，s 5A基础培养基，现配现用。实验组SAL-1、SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5的红景天苷浓度分别为4、8、16、30和40μmol/mL ，CG组不加药。

[基金项目]：西北民族大学研究生科研创新项目（项目编号：Yxm2020127）；[作者简介]：白生菊（1994-），女，甘肃临夏人，在读硕士研究生，主要从事动物医学生殖技术研究；[通讯作者]：魏锁成（1962-），男，甘肃天水人，教授；主要从事动物生殖生物技术的教学和科研工作；

配制10%胎牛血清、0.1%双抗的McCoy^，s 5A完全培养液，培养SKOV3细胞于CO₂浓度为5%、温度为37℃、饱和湿度下的恒温培养箱，24h换液。取对数生长期的贴壁细胞，消化稀释至2 ×10⁴/mL的细胞悬液铺于6孔板和96孔板，各孔加入相应浓度的红景天苷。

1.2 CCK-8法检测SKOV3细胞增值的抑制率

96孔板每个药物浓度设置5个复孔。分别在24h、48h和72h时每孔加10μL CCK-8溶液，培养箱温育3h，多功能酶标仪测定450nm处OD值，根据公式：[(Ac-As)/Ac-Ab)]*100%As（As为SAL实验孔、Ac为CG、Ab为空白）计算抑制率。

1.3 qRT-PCR法检测PTEN mRNA的表达

PTEN上游引物5′-GACCAGAGACAAAAAGGGAGTA-3′，下游引物5′-ACAAACTGAGGATTGCAAGTTC-3′，长度为149bp；GAPDH上游引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′、下游引物5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，长度为120bp，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

取6孔板，分别在24h、48h和72h收集细胞，用Trizol法提取总RNA，逆转录试剂盒逆转录为cDNA，20μL体系PCR扩增，95℃ 30s，95℃ 10s，53℃ 30s，40个循环，用2^-△△CT法计算PTEN mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.4 Western-blot法检测PTEN 蛋白表达水平

取6孔板，RIPA裂解细胞提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后将蛋白转移至PVDF膜，TBS-T封闭液封闭2h。分别用Anti-PTEN Antibody（1∶1000）和Anti-GAPDH Antibody（1∶1000）4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，洗涤3次，化学发光试剂显影。凝胶图像分析仪扫描，Image 软件分析各条带灰度值。以GAPDH作为内参，目的条带产物灰度值与同组GAPDH 产物灰度值之比为PTEN蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5 数据分析

采用SPSS v.21.0统计分析数据，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

2结果

2.1 CCK-8法检测SKOV3细胞增值的抑制率

红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的抑制率随着红景天苷浓度的增加逐渐升高（图1），分别在24h、48h和72h时，SAL-2和SAL-3实验组的抑制率显著高于CG组（P<0.05），SAL-4和SAL-5实验组的抑制率极显著高于CG组（P<0.01）；SAL-3和SAL-4实验组的抑制率显著高于SAL-1组（P<0.05），SAL-5实验组的抑制率极显著高于SAL-1组（P<0.01）。结果表明，红景天苷呈剂量-时间依赖性地抑制卵巢癌细胞SKOV3的增值。

注：^*P<0.05与CG组比较；^##P<0.01与SAL-1组比较

图1红景天苷作用SKOV3细胞的抑制率

2.2 qRT-PCR法检测PTEN mRNA的相对表达水平

图2所示，红景天苷作用于SKOV3细胞24h时，SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5浓度组的PTEN mRNA的相对表达量极显著高于CG组和SAL-1组（p<0.01）；作用48h时，SAL-3、SAL-4和SAL-5组显著高于CG组和SAL-1组（p<0.05，p<0.01），SAL-1和SAL-2组与CG组间无显著性差异；作用72h时，SAL-3、SAL-4和SAL-5组显著高于CG组和SAL-1组（p<0.05，p<0.01），SAL-2组显著高于CG组（p<0.05），SAL-1组与CG组间无显著性差异。结果显示，红景天苷呈剂量依赖性的促进卵巢癌细胞SKOV3 PTEN基因的相对表达。

注：^*P<0.05与CG组比较；^##P<0.01与SAL-1组比较

图2 红景天苷对PTEN mRNA表达的影响

2.3 Western-blot法检测PTEN蛋白相对表达水平

图3所示，红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3 24h、48h和72h时，SAL-4和SAL-5组PTEN蛋白的表达量极显著高于CG组和SAL-1组（P<0.01），作用24h时，SAL-3组的表达量显著高于CG组（P<0.05）。结果显示，随着红景天苷浓度的增加，SKOV3细胞PTEN蛋白的表达量也随之增加.

注：^*P<0.05与CG组比较；^##P<0.01与SAL-1组比较

图3红景天苷对PTEN蛋白表达的影响

3 讨论

红景天苷在抗肿瘤中发挥着重要的作用，抑制人舌鳞癌、肝癌等的发生发展^[8、9、10]。本研究溶解不同浓度的红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3，结果发现，红景天苷明显改变SKOV3细胞的形态，呈剂量-时间依赖性地抑制SKOV3细胞的增值，Yu Ge等^[11]研究显示红景天苷通过上调凋亡诱导因子抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3的增值，与本研究结果基本一致。

PTEN基因表达量的上调可介导PI3K/AKT信号通路的改变^[12]。本研究结果表明，30μmol/mL和40μmol/mL红景天苷显著促进SKOV3细胞PTEN mRNA和蛋白的相对表达，红景天苷可能是通过上调PTEN基因的表达介导PI3K/AKT信号通路实现抑制卵巢癌的作用。王志强等^[8]研究显示，红景天苷通过PI3K/AKT信号通路诱导人舌癌细胞的凋亡，红景天苷对人舌癌细胞的抑制机制与本研究结果基本一致。Yu Ge等^[11]的研究显示，红景天苷可能通过激活caspase-3，参与caspase信号通路以及p53等信号通路诱导卵巢癌SKOV3和A 2780细胞的凋亡，其抑制机制与本研究结果不一致。因此，红景天苷对卵巢癌的抑制机制还有待进一步的研究。

3 结论

红景天苷明显改变卵巢癌SKOV3细胞的形态和贴壁状态，呈剂量-时间依赖性地抑制SKOV3细胞的增值，其抑制作用可能是通过促进PTEN的表达实现的。

1参考文献

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Inhibition effects and of salidroside on the growth of

SKOV3 ovarian cancer cell and its mechanism

BAI Sheng-ju ,WEI Suo-cheng

(Life Science and Eengineering College,Northwest Minzu University,Lanzhou 730030 China)

[Abstract]: In order to explore the effect of salidroside on the growth of ovarian cancer cell SKOV3 and clarify its mechanism of action. In this experiment, salidroside with concentrations of 4, 8, 16, 30 and 40 μmol/mL were selected, followed by SAL-1, SAL-2, SAL-3, SAL-4 and SAL-5 groups, and a control group ( CG) No medication. Culture ovarian cancer cells SKOV3 in vitro, observe the status of SKOV3 cells in each experimental group with an inverted microscope, CCK-8 method to detect the inhibition rate of SKOV3 cell proliferation, qRT-PCR method to detect the expression of PTEN mRNA in SKOV3 cells, Western-blot method to detect each experiment Group PTEN protein expression level. The results showed that salidroside significantly changed the morphology and adherence status of SKOV3 cells. With the increase of salidroside concentration, the spindle cells gradually became round and the number of adherent cells decreased. The cells in the culture medium of the SACI-5 group The debris is the most, and adherent cells are rare. With the increase of salidroside concentration and prolonged action time, the inhibition rate of SKOV3 cells increased, and salidroside significantly promoted the expression of PTEN mRNA and protein in SKOV3 cells. The results showed that salidroside inhibited the proliferation of ovarian cancer cell SKOV3 in a dose-dependent manner, and significantly promoted the expression of PTEN mRNA and protein in SKOV3 cells. Therefore, salidroside may play its role by regulating the expression levels of PTEN mRNA and protein.

[Key words]: Salidroside; Ovarian cancer cells;PTEN