巢湖流域污水处理厂中抗生素抗性基因去除研究

葛程畅 1，张桢 2

1. 合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥 230000

摘要：本研究采用实时荧光定量PCR技术对巢湖流域4所城镇污水处理厂主要生物处理工艺单元进出水中典型四环素类抗性基因(tetG、tetO、tetW)和磺胺类抗性基因(sulⅠ、sulⅡ)的浓度进行了检测，考察抗生素抗性基因（ARGs）的去除情况。结果显示，生物处理单元SBR、氧化沟、A/A/O等由于污泥沉淀作用,对抗性基因的去除效果显著，达到1~2个数量级。

关键词：抗生素抗性基因；污水处理厂；实时荧光定量PCR

抗生素的过度使用和误用不仅会导致抗生素本身的化学污染，还会对环境生物造成选择性压力，并导致ARGs在环境中的出现和传播^[1-3]。污水处理厂被认为是抗性基因的重要储存库^{[4, 5]}。污水处理过程中抗性基因的持续存在不仅对自然环境造成严重的生态风险，而且对污水的再利用及其经济可行性产生负面影响。揭示污水处理过程中抗性基因的变化特征，研究有效控制抗性基因传播的策略尤为重要。

本研究选取巢湖流域内四个污水处理厂的污水处理系统作为研究对象，采取SBR、氧化沟、A/A/O等生物工艺处理前后的污水样品，采用实时荧光定量PCR技术对5种ARGs（sulⅠ、sulⅡ、tetO、tetW、tetG）进行定量检测。分析比较ARGs在不同工艺流程中的去除效果，为有效控制抗生素抗性基因污染提供一定的理论依据。

1. 材料与方法

1.1样品预处理

样品采集于2019年4月进行。水样的采集采用人工采样，在4个城镇污水处理厂主要采集了各污水厂生物处理单元（SBR、二沉池、改良氧化沟、厌氧池、氧化沟、A/A/O）的进水和出水。每个采样点的水样取250mL，存放于事先清洗好的聚乙烯塑料瓶中，并置于4℃冰箱中保存，在24h内完成样品的预处理。

1.2 DNA提取

参照FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）的使用说明书提取各水样的DNA。提取的DNA采用超微量分光光度计（NV3000C）检测含量，其纯度A260/A280在1.8~2.0之间，表明所提取的DNA样品纯度较高，可进行下一步的实验。

1.3定量PCR

通过实时荧光定量PCR技术检测绝对丰度值。取浓度适宜，纯度高的质粒，计算其拷贝数。将已知拷贝数的质粒标准品用DEPC水稀释，并控制质粒拷贝数在10²~10⁹ copies之间，按顺序依次添加0.4ul的前置引物、后置引物、10ulSYB染液、0.4ulROX、1.0ulDNA样品、7.8ulDEPC水，建立20ul体系。

2. 结果与讨论

2.1生物处理工艺ARGs的进水浓度

图1为各类水样检测基因的进水浓度，检测生物工艺水样中ARGs绝对丰度为10^4.20-10^6.47copies/mL，其中sul1和tetG丰度较高，分布较广泛。不同工艺以及地区受纳水体不同使得ARGs的分布不完全一致，但基因丰度仍较高，如果抗性基因不能得到有效处理，残留基因会再次进入环境，改变微生物群落结构，细菌产生耐药性。

图1生物处理工艺ARGs的进水浓度

2.2生物处理工艺对ARGs的去除情况研究

从图2可看出，在六种工艺中五种目标ARGs均被检出。经过生物处理后的ARGs丰度相对进水均有所降低，其中二沉池中tetO丰度降低至10^2.82copies/mL。试验结果表示SBR、改良氧化沟、二沉池、厌氧池对五种目标ARGs均有去除效果，总体上SBR的去除效果最好。六种工艺对不同的ARGs的去除效果也不同，其中SBR对tetO和tetW的去除效果最好，对数去除值分别达到1.54和1.41。相对而言改良氧化沟对tetO和tetW的去除效果最好，对数去除值分别达到0.55和0.79，而对sul1、sul2、tetG的效果微乎其微，LRV分别为0.01、0.01、0.07。经过二沉池处理后，sul2和tetO的LRV相对最高，可达1.28和1.15。厌氧池对四环素类ARGs（tetG、tetO、tetW）的去除率要高于磺胺类ARGs（sul1和sul2），LRV最高可达1.18。而经过氧化沟处理后，虽然tetW可达1.16个数量级的去除率，但是tetO不减反增，可见即使同为四环素类抗性基因以及保护核糖体的蛋白基因，同一工艺的处理效果仍然不同。在本试验中，氧化沟的处理效果优于改良氧化沟。A/A/O对sul2、tetO、tetW的LRV分别为0.6、0.58、0.65，不能去除sul1。

图2生物处理工艺ARGs的去除率

本研究选择的生物工艺均为活性污泥法，试验结果表明生物处理相对物理处理更能有效去除ARGs。这可能是因为活性污泥具有较大的表面积，在其表面上栖息着具有强大生命力的微生物群体，在其外部覆盖着多糖类的粘质层。当其与污水接触时，污水中部分污染物会被活性污泥所凝聚和吸附。被摄入细胞内的污染物一部分作为微生物生存的营养基质，一部分被代谢。被代谢的部分也意味着去除了部分ARGs，这样出水中的ARGs丰度大大降低，但ARGs并未完全去除，这可能是因为有部分游离和残缺的DNA片段随处理水流出。

3. 结语

1. SBR对tetO、tetW的去除率较高，可达1.41-1.54个数量级，厌氧池对整体基因的去除效果较佳。

2. 不同工艺对不同基因的去除效果不同，ARGs的去除原理仍需更多的研究。

参考文献

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[5] 李中浤, 杜彩丽, 陈素华, 张列宇, 李晓光, 黎佳茜, et al. 一体化A²/O-MBR处理系统中抗性基因分布及去除效果研究 [J]. 中国环境科学: 1-11.

作者简介：葛程畅（1995-），女，安徽省铜陵市，硕士，污水处理