微生物在造纸工业废水处理中的应用

刘 晓

身份证号码： 41082519820822****

摘要：厌氧生物处理工艺技术及其装置相对简单，其处理工艺在处理工业废水的有机负荷是好氧工艺的5—10倍，不仅提高了微生物的活性，其废水处理效率也由于好氧处理。因此，厌氧生物技术在工业废水处理中的应用及其广泛。对传统微生物群落监测法、水生生物毒性监测法和基于分子生物学技术的微生群落监测法等在工业废水监测领域的研究及应用进行了综述，并对存在的问题进行了总结。建议后续进一步完善工业废水生物监测体系时，参考国外成熟经验，制定出符合国内需求及特征的工业废水生物监测方法与评价标准，以便更好地掌握工业区整体环境健康及污染状况。

关键词：微生物；技术；废水；工业废水

1导言

微藻是一类在自然界中分布广泛的微生物,具有较强的适应性,因其可高效吸收氮磷营养及较高的化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率而被应用于废水处理。利用废水培养微藻可在废水净化的同时积累微藻生物量,用于生物柴油、生物饲料等领域,大幅降低微藻的培养成本,进而实现废水的无害化处理与资源化利用。

2材料与方法

2.1废水来源与分析方法

实验所用造纸废水来源于陕西某造纸厂二沉池出水,经纱布过滤除去悬浮固体物后测定其水质。总氮和总磷浓度分别采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法与钼酸铵分光光度法测定;COD采用连华科技5B-6C多参数水质测定仪测定;色度采用恩帆EFS-3D色度测定仪测定。造纸废水水质指标如表1所示。

表1 造纸废水水质指标

2.2微藻的来源与培养

棕鞭藻属(Ochromonas sp. MN028526) 分离自陕西科技大学人工湖。利用BG11培养基培养棕鞭藻,取BG11培养基100 mL并置于250 mL三角瓶中,接种藻株至棕鞭藻培养液OD540为0.2。将棕鞭藻培养液于光强3 000 lx、温度28 ℃、光周期L∶D=14 h∶10 h、摇床转速150 r/min的条件下培养至稳定期。

2.3棕鞭藻共栖细菌分离、培养与鉴定

将培养至稳定期的棕鞭藻培养液用无菌水以1∶10的比例逐级稀释,取100 μL稀释至10-4～10-6的稀释液,涂布至LB培养基(蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 5 g/L、氯化钠 10 g/L) 中,分离棕鞭藻的共栖细菌。将平板置于28 ℃培养箱中2～3 d,分离不同的菌落,多次划线培养直至获得单一、纯净的菌落。

利用LB液体培养基培养分离获得的共栖细菌,培养至稳定期后1 000g离心,获得菌株。利用细菌基因提取试剂盒(Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒) 提取细菌DNA。利用已提取的基因组DNA为模板,采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 进行PCR扩增[20]。PCR反应体系(25 μL) 为Taq PCR Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L的正反向引物各1 μL,DNA模板1 μL,加纯水补充至25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性3 min,61 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,29个循环;循环结束后72 ℃延伸5 min,最后12 ℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,经核酸染料染色后用凝胶成像系统进行验证,使用胶回收试剂盒对混合后的PCR产物进行切胶纯化,将纯化产物进行细菌宏基因组16S rDNA测序,测序区间为V3～V4可变区,测序平台为Illumina MiseqTM,委托生工生物工程有限公司完成。将测序获得的16S rRNA序列上传至NCBI网站,进行BLAST比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),然后用MEGA7.0构建进化树。

2.4构建棕鞭藻与细菌的共培养体系

将分离获得的细菌与微藻共培养,进一步研究细菌对微藻生物量积累的影响。将棕鞭藻与分离获得的细菌分别培养至对数期,8 000 r/min离心5 min后弃上清,按比例取适量加入到BG11培养基或废水中振荡培养。

3造纸废水对微藻生长的影响

将造纸废水用不同比例纯水稀释(分别为原水、稀释2倍废水和稀释5倍废水),灭菌后接入微藻培养物或藻菌共生培养物,培养8 d测其每日叶绿素a浓度。微藻叶绿素a总体变化趋势相似,在稀释2倍废水培养的藻菌共生体系中叶绿素a含量始终保持最佳,在培养第8 d时,叶绿素a含量高达10.952 mg/L,此时体系中微藻干重为1.073 g/L。相较于其他稀释倍数,当造纸废水稀释2倍时,纯藻和藻菌共生体系中的微藻的生物量积累均处于更高的水平。与未经稀释的废水体系相比,纯藻和藻菌共生体系中微藻的叶绿素含量在第8 d分别高出36%和34.33%。结果说明稀释2倍的造纸废水中氮磷等营养条件更适宜微藻的生长,在该稀释度下废水中总氮、总磷浓度大约为11.21 mg/L和2.45 mg/L。需要特别指出的是,除纯藻和藻菌共生体系在稀释5倍废水比生长速率基本相等外,其余两组微藻在藻菌共生体系生长比纯藻系统好,说明藻菌之间形成了良好的共生作用,此时细菌给棕鞭藻提供CO2进行光合作用,同时细菌吸收棕鞭藻产生O2及其他有机物。

4微生物在造纸工业废水处理中的应用

4.1厌氧生物处理系统的应用

厌氧生物处理技术在工业废水处理中的应用及其广泛。虽然厌氧处理技术操作相随简单，技术相对成熟，但处理不当会导致硝酸盐和反硝化物的产生。厌氧处理过程中，除产甲烷的处理过程外，还包括硫酸盐还原、反硝化与厌氧氨氧化的过程。产甲烷的过程其目的是为了借助微生物细胞的间接作用来处理工业废水中的有机物在厌氧环境下分解成为少量污泥和甲烷，实现污泥的减量化处理和有毒有机物的分解作用。硫酸盐的还原过程会和产甲烷菌争夺底物，一直产甲烷菌的繁殖，从而降低厌氧生物处理工业废水的效果。

4.2微生物群落监测法

过去，工业废水大多未经处理直接排放至自然水体，而如今大部分污水均通过污水处理厂或纳入污水处理管网处理后达标排放，导致排水中微生物群落的数量及种类较过去大幅下降，因此，如仍采取传统PFU法进行微生物群落监测，存在富集时间长、时效性差等问题。不断发展的分子生物学技术为微生物群落监测提供了新方向，该技术可以同时从物种和基因水平评估微生物群落的丰度和多样性等特征。基于核酸杂交的微生物群落分析方法是在一定条件下以被标记的特异性单链核苷酸片段为探针，根据碱基互补配对原则，与目标样品中微生物的核苷酸形成杂交分子，从而通过自显影或者发光技术对微生物群落结构进行分析。利用该技术可以在短时间内对废水中的菌种丰度、多样性和一些重要致病菌进行检测，提高了微生物检测的时效性。核酸杂交技术无需对目标基因进行聚合酶链式反应(PCR)，可以减少PCR过程中产生的误差，但未经扩增的基因浓度较低，也会给检测带来困难。同时，由于微生物存在亚群类的差异，如果设计的探针核苷酸序列与某些亚群目标基因的互补性较差，会造成某些微生物群落检测结果的假阴性。

为进一步降低样品量大小、采样难易程度的限制，高通量测序技术也被应用于对微生物群落结构及多样性的深入研究，尤其是二代测序技术使直接研究自然条件下的微生物种群结构与动态变化成为可能，还把对环境微生物的认识从物种水平上升到基因功能水平，极大地拓展了对环境微生物的认知。HU等应用高通量测序技术对采用不同处理工艺的污水处理厂曝气池中的微生物群落进行了监测研究，发现处理方法的差异会直接导致污水中优势菌群的改变。LU等利用该技术研究了不同类型生产企业排放的废水对受纳河道中微生物生态系统的影响，发现各类废水均会影响水生生态系统的自然变化，导致环境生物均质化。

综上，基于微生物群落的废水生物监测技术可以准确、直观地反映水质突变，被广泛应用于水环境质量与状况监控预警。在微生物群落监测中引入分子生物学技术，可以更加快速地获得水体中微生物的结构、功能及遗传多样性等信息，便于优化和调整污水处理系统。

结束语

综上所述，作为一种综合性监测技术，工业废水生物监测已不再仅仅是理化监测的补充，它可以从宏观和微观角度全面深入地审视水环境质量状况，进而对其产生的生物健康效应进行直观评价。建议在工业废水处理中，将厌氧生物处理技术与其他污水处理技术相结合，并在污水处理系统中增加多个厌氧生物处理环境，来提高厌氧生物系统性处理的效果。

参考文献：

[1]朱冰清,姜晟,蔡琨,张小琼,李旭文,徐东炯,刘佳.生物监测技术在工业废水监测领域的应用研究[J].中国环境监测,2021,37(01):1-10.

[2]吴宇峰.厌氧生物技术在工业废水处理中的应用[J].科技风,2021(05):183-184.