4种不同结核分枝杆菌检测方法对结核病的诊断价值分析

王娟

黑龙江省鸡东县人民医院 158200

【摘要】目的：分析结核分枝杆菌的检测方法。方法：收集60份肺结核患者的痰液标本，分别采用涂片抗酸染色、荧光染色法、罗氏培养和DNA环介导恒温扩增试验检测结核分枝杆菌，同时比较四种方法的阳性检出率。结果LAMP试验结核分枝杆菌检出率为72.2%，高于罗氏培养法57.8%，也高于荧光染色的60%，显微镜下抗酸染色法的检出率为四种检测方法中最低的一种，为51.7%，显著低于LAMP法。结论：LAMP试验检测痰结核分枝杆菌具有速度快、敏感度高、便捷、特异性强的特点在肺结核的早期诊断当中其作用十分显著。

【关键词】抗酸杆菌；结核分枝杆菌；荧光染色；核酸扩增技术

结核病是目前严重威胁人类健康的重大传染性疾病之一，但只要早期诊断和合理用药，绝大多数的结核病人是可以治愈的。然而现有的结核病实验室诊断方法远不能满足临床诊治的需要，因此快速、准确的诊断方法研究尤为重要。我们采用涂片、培养、聚合酶链反应(PCR)和增菌PCH四种方法对可疑结核病人痰标本进行检测，以比较和评价各种检测方法的临床应用价值[1]。

1资料与方法

1.1一般资料 选择我院2018年8月~2019年8月收治的60例肺结核患者，其中男46例，女14例，患者年龄38~79岁，平均年龄（50.3±4.1）岁。其中新患者52例，初治失败1例，复治7例。

1.2试剂与仪器 萋－尼染色试剂，酸罗氏培养基、ＬＡＭＰ试剂、显微镜、低温高速离心机、生物安全柜、ＰＣＲ扩增仪。

1.3方法 叮嘱患者于清晨漱口，之后在无菌塑料瓶当中咳出2~3口痰，患者的痰液标本为3份，共180份，检验中采用没分合格痰标本。此外还要开展萋－尼式染色，金胺染色镜检、罗氏培养以及LAMP试验[2]。

1.3.1萋－尼染色显微镜检查 检查中，涂片、染色和显微镜检查操作均严格按照操作规范的要求进行，荧光染色镜检标准：以暗色为背景，抗酸杆菌为黄绿色或橙色的荧光。

1.3.2罗氏培养法 取患者痰液标本，使用浓度为3%的火碱进行预处理，观察标本的性状及状态。加入2~3倍体积的处理液，将其溶入无菌痰杯当中，从而更好地保证痰液液化的效果，此外应于20min内接种两支酸罗式培养基。

1.3.3LAMP试验 在痰液样品DNA制备中，应对痰液标本量进行初步的估计，同时应加入4倍体积质量分数为4%的火碱溶液，将其充分混合，在室温条件下静置液化30min。吸取1ml的液化液，将其加入到1.5ml无菌离心管当中，以15000r/min的速度离心5min，弃上清。沉淀环节采用体积为1ml的生理盐水，对其进行重悬洗涤，以15000r/min的速度离心5min，弃上清，将其沉淀在木板上以提取备用。后分别加入100μl DNA提取液I和25μl ProteinaseK，在56℃的条件下温浴30min，后在沸水中水浴10min,jiaru12.5μl DNA提取液II，将其混合均匀，以12000r/min的速度离心5min,将其进行上清处理后即制成DNA模板[3]。

在核酸扩增当中，应取出n支HF管，在25℃室温条件下进行解冻处理，按顺序向反应罐内分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5μl，将其置于65℃的温度条件下恒温反应60min。反应全部结束后，应将HF管倒置甩动2次，后正置甩动2次，从而可有效保证工作液和显色液的混合效果，冷却至室温后对其进行实时观察。待检样品呈绿色，且该样品结果为结合分枝杆菌阳性，待检样品反应管中应呈橙色，满足上述条件即可报告结核分枝杆菌检验结果为阴性。

2结果

2.1结核分枝杆菌检测阳性率 萋－尼染色法中阳性份数为93例，阳性率为51.7%，荧光染色法阳性份数为108例，阳性率为60%，LAMP试验阳性份数为130例，72.2%，罗氏培养的阳性份数为104例，阳性率为57.8%。LAMP试验发检测结合分枝杆菌的阳性率与萋－尼染色法相比，求差异具有统计学意义，与罗氏培养法及荧光染色法相比，差异具有统计学意义，荧光染色法与萋－尼染色法相比差异无统计学意义。

2.2LAMP试验结果 该试验的结果通过肉眼即可判断，无靶序列DNA为橙色。含靶序列DNA管中含有大量的LAMP扩增产物，所以其为绿色。

3讨论

在传染源判断中，结核病细菌检查发挥着非常重要的作用，同时其也为结核病的诊断及治疗提供了理论基础。痰涂片抗酸染色法是临床上应用较广，同时也是最为基础的细菌学检测方法。该方法较为显著的优势是操作便捷，速度快，经济投入相对较少，但其也存在不足，其敏感度低、特异性差，无法有效分辨死菌和活菌。必须要达到5000~10000条菌/ml才能出现阳性检测结果[4]。此外，检测过程中不同类型的抗酸杆菌能够着色，在这样的状况下只有采取有效措施进一步确定其是否为结合分枝杆菌。

细菌培养法在临床上的主要特点是灵敏度比涂片法稍高，同时，这种方式可十分有效地分辨死菌和活菌。其在临床上也被称为结核病诊断的“黄金标准”。但其也存在不足，这种方法主要的缺点是需要较长的时间，通常4~8周才能取到结果，此外，非分枝结核杆菌也可繁殖，所以还需判断细菌是否为分枝结核杆菌，所以也在一定程度上影响了该方法的广泛应用。

综上，LAMP试验在临床应用中十分快捷便利，且其具有较高的特异性，灵敏度也相对较高，因此也是一种比较适合应用于结合分枝杆菌检测的关键技术。这种方式模板DNA提取相对比较简单，不需要繁杂的仪器设备支持，且用揉眼就可迅速判断检验的结果，所以也比较适合在临床上予以广泛应用。

参考文献

[1]喻容,胡发莉,石国民,等.4种检测方法在结核病临床诊断中的应用价值[J].国际检验医学杂志,2016,37(5):580-582.

[2]郑颖,徐冬梅,丁文杰,等.4种不同检测方法对肺结核的诊断价值比较[J].中国乡村医药,2016,23(1):65-66.

[3]吴科明,莫实德.4种方法在检测痰内结核分枝杆菌结果的比较分析[J].检验医学与临床,2012(20):2577-2578.

[4]郑强,李朝金,苟莉,等.多种肺结核临床实验室诊断方法的比较分析[J].国际检验医学杂志,2014(21):2941-2942.