用于新型冠状病毒核酸检测的即时检测方法研究

严怡娟

河南省三门峡市中心医院 河南省三门峡市 472000

摘要：目的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（coronavirusdisease2019，COVID-19）在全世界范围内快速传播，截至2020年9月30日全球感染人数已达3300万人，造成100多万人死亡，给公众的生命健康造成严重威胁。基于实验室的标准化核酸检测方法周转时间长、成本高，因此急需开发便捷检测新冠病毒的方法，实现在资源有限的情况下快速测试以及时控制疫情。

关键词：新型冠状病毒；核酸检测；即时检测方法

引言

2019年12月以来，发现了多例新型冠状病毒肺炎患者，随着疫情的蔓延，我国其他地区也相继发现了此类病例。自疫情爆发来，COVID-19患者也逐渐增多。本研究用于新型冠状病毒核酸检测的即时检测方法研究。

1呼吸道感染病原体的检测现状

1.1呼吸道感染病原体抗体检测

针对COVID-19的疫情，许多高新企业已成功研发了SARS-CoV-2的IgM抗体检测试剂盒(胶体金免疫层析法)以及SARS-CoV-2的IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)2种检测方法学的产品。胶体金免疫层析法检测试剂的特点为：15min出结果，无需仪器，适合现场快速筛查。呼吸道病原体九联检采用九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂(间接免疫荧光法)，同时检测甲型流感病毒(influenzaAvirus，INFA)，乙型流感病毒(influenzaBvirus，INFB)，副流感病毒1型、型及3型(parainfluenzavirustype1，2，3PIV)，嗜肺军团菌(legionellapneumophila，LP)，肺炎支原体(mycoplasmapneumonia，MP)，Q热立克次体(Qrickettsia，QFB)，肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae，CPn)，腺病毒(adenovirus，ADV)，呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)等9项病原体的IgM抗体。呼吸道病原九联检的检测方法在呼吸道感染检测中检出的阳性率高，能够同时检测9种病原体，可及时发现感染的病原体，为临床呼吸道感染疾病的诊断及鉴别诊断提供一定的支持依据。

1.2甲型流感病毒快速基因分型POCT方法

ParaDNA核酸POCT检测仪及其配套的HyBeacon荧光探针检测技术，是当前POCT分子诊断的前沿代表。该方法建立一种基于Beacon-ParaDNA技术平台对甲型流感病毒进行快速基因分型的方法，由于具有准确度和灵敏度高、设计灵活、兼容性好、无交叉污染及支持现场快速检测等特点，已广泛应用于法医学鉴定、病原微生物检测、食品卫生安全以及药物基因组学等领域。

2检测方法

2.1实时荧光检测

实时荧光检测原理为在体系中添加化学发光物质从而扩增在过程中读取荧光信号以实现定量。在RT-PCR常用的方法为嵌入荧光染料法和Taqman探针法。嵌入荧光染料法是指使用能与DNA扩增产物非特异性结合的荧光染料（例如SybrGreen），Taqman探针法是指设计包含5′荧团和3′淬灭基团的短的寡核苷酸探针与DNA模板中的序列退火，Taq聚合酶通过其5′至3′核酸外切酶活性切割退火的探针上的荧光基团，使其发出荧光。测定扩增产物荧光信号达到荧光阈值时经历的扩增循环数（Ct）即可进行定量。RPA在常温下就可以反应，其结果可以通过与exo探针结合进行实时荧光定量。引入内部淬火探针（exo-IQ）的概念，猝灭基团通过内部linker连接在两个核苷酸之间，克服了exo探针对胸腺嘧啶距离的设计限制，该策略大大简化了exo探针的设计。在标准化实验室采用的实时荧光检测需要体积较大的实时荧光检测仪，检测人员也需要经过专业训练，因而专门为即时检测开发的商业化检测仪器对实时荧光检测仪进行小型化处理，使其与样本提取扩增整合并且使结果易于读取，更适合即时检测环境，但由于仍需专门的仪器，在成及推广应用方面存在限制。

2.2侧向流检测

基于纸张的侧向流分析（LFA）成本低，易于制造且与即时检测完全兼容，是居家检测或资源贫乏地区检测的富有潜力的工具。进一步提出一种更简化的甚至可以在家中进行检测的RT-RPA方法，设计了nfo-affinity探针系统以及用于RNA检测的侧向流动试纸条，可以目视检测到最低1agN基因RNA，考察发现该方法可以简单地通过使用保温杯来执行。AuNPs合成便利，表面可以被数百种核酸修饰。可通过由AuNPs聚集引起的颜色变化进行比色测定，闭管的反应形式可以最大程度地减少操作步骤并避免交叉污染。

2.3酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（ELISA法）是一种对待测抗原抗体进行定量的检测方法，该方法通过酶标三元复合物与酶催化底物的颜色反应，对待测物定量检测。采用2种ELISA检测试剂盒对214名SARS-CoV-2确诊患者体内的IgM和IgG抗体进行检测，并对ELISA检测试剂盒的诊断可行性进行了评价。2种ELISA检测试剂盒，分别是基于核衣壳蛋白（rN）的ELISA检测试剂盒和基于棘突蛋白（rS）的ELISA检测试剂盒；采用基于rN的ELISA检测试剂盒对IgM和IgG检测的成功率分别是68.2%和70.1%，基于rS的ELISA检测试剂盒对IgM和IgG检测的成功率分别是77.1%和74.3%，数据结果表明基于rS的ELISA检测IgM的灵敏度明显高于基于rN的ELISA检测方法。同时研究人员还发现，基于rS和rN的ELISA检测方法对于发病10d后的患者样本具有更高的灵敏度，对IgM和IgG抗体的阳性检出率大于在发病初期时的阳性检出率。因此，ELISA可作为SARS-CoV-2诊断的重要辅助方法，尤其是对发病10d后的患者的血清样本的检测。虽然ELISA法具有较高特异性和灵敏性，但是检测过程中容易被污染，操作步骤烦琐，其并不像核酸检测那样普遍用于爆发性传染病的快速检测。

结束语

综上所述，作为病原学直接检测指标SAＲS-CoV-2核酸检测在新型冠状病毒肺炎防治过程中具有不可替代的作用，但在临床大规模应用前仍需优化各类检测技术，进行比对验证。同时需加强实验室质量管理，规范标本采集和实验室操作，以为临床提供更加准确可靠的检测结果，为疫情防控提供有价值的指导。

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