纳米操纵中机械力诱导DNA突变的卡方检验分析研究

段娜

中国人民大学，统计学院，北京 100872

摘要

多种环境因素（包括辐射，热量和氧自由基）引起的DNA损伤可在DNA复制过程中诱导突变。研究表明，基于原子力显微镜（AFM）单分子操纵技术的机械力可诱导DNA损伤及在DNA复制过程中诱导突变。然而，并没有进一步证明其结果有没有显著统计学意义。本文旨在用卡方检验方法（Chi-square）来比较三种DNA样品（纳米操纵DNA（n=22），拉伸DNA（n=223），稀释DNA（n=180））中的DNA突变比率。从而得出机械力诱导DNA突变比率和拉伸DNA、稀释DNA中的突变比率相比具有显著统计学意义。

关键词：卡方检验（Chi-square test），DNA突变，纳米操纵

前言

DNA 突变(DNA mutation)是DNA结构中碱基所发生的改变。DNA突变是生命进化的动力。复制过程中聚合酶的不准确性是导致DNA突变的重要原因。其他原因包括遗传物质的物理或化学伤害[1-3]，如辐射，热量和氧自由基。随着分子生物学和诱变技术的进步，越来越多方法都能诱发遗传物质的变化[4]并定性检测基因变化[5, 6]。

迄今为止，对于这种机械力是否会在操纵过程中引起DNA损伤尚知之甚少。在体内条件下，DNA分子在许多生物学过程中都受到机械力的作用[7]，DNA转录，基因表达和DNA复制。例如，在复制过程中，必须强制解开由DNA解旋酶产生的亲本DNA链。尚不清楚机械力是否会导致DNA损伤和突变。因此，重要的是在一定的力存在下测量DNA的损伤和突变显得尤为重要。

光镊和扫描探针显微镜可以操纵单个DNA分子或蛋白质[8]。对单个DNA分子的广泛研究集中于其机械性能[7]。原子力显微镜（AFM）不仅可以在单分子水平上显示和操纵衬底上的天然生物样品[9, 10]，而且可以精确地控制AFM对生物样品施加的机械力 [11, 12]。在之前的研究中，我们研究了机械力诱导的DNA突变[13]基于原子力显微镜（AFM）的单分子操作，单分子聚合酶链反应（SM-PCR）和Sanger测序的结合 [14-16]。在本文中，我们旨在研究使用卡方检验方法得出P值来评估基于AFM的单分子操纵DNA与未操纵的DNA相比DNA的突变率是否会有不同。

实验材料与方法

DNA提取

569bp DNA 自pBR322 (TaKaRa Bio. Inc., Dalian, China)扩增(3,632th to 4,200th)，聚合酶为Ex Taq DNA polymerase Hotstart (TaKaRa Bio. Inc.)，随后纯化保存在TE缓冲液中。

PCR 扩增

DNA片段引物：

(P1: 5’-GTCGTTTGGTATGGCTTCA-3’)

(P2: 5’-GACAATAACCCTGATAAATGCT-3’)。由上海生工生物工程有限公司合成。 “分子梳”方法[13, 16]将DNA制于3-氨丙基三乙氧基硅烷( (3-aminopropyl)-triethoxysilane，APTES)修饰的云母衬底上[17]。DNA的成像和操作是通过多模AFM和硅悬臂在空气中进行的。为了进行操作，将AFM尖端向下放到表面并扫描目标DNA分子。然后，通过原子力显微镜尖端分离云母上的目标DNA分子。如图1所示，将带有AFM尖端的分离的DNA片段（569 bp）转移到灭菌的PCR管中，并通过单分子PCR进行扩增。

在对照组中，将作为主要对照组的稀释DNA用作PCR模板。此外，首先将DNA分子在APTES-云母上拉伸[17，18]，然后用次要对照组Milli-Q水洗脱。稀释洗脱的DNA，并将其用作PCR模板，如图1所示。

图1 不同组中DNA的扩增和测序，包括稀释，拉伸和操纵。该实验中使用的DNA分子的长度为569 bp [13]

统计分析

卡方检验用于评估操纵与DNA突变之间是否存在关联 [19]。皮尔逊（Pearson）卡方分布的重要性在于，统计学家可以使用不依赖于正态分布的统计方法来解释发现。计算卡方统计量的公式为：

其中，O代表观测频率，E代表期望频率。从观察到的计数中减去期望的计数以找到差异。然后计算差值的平方以消除负值。然后，将差的平方除以期望值以归一化。它们前面的sigma符号表示我们为每个单元格加和计算出这些值。由于DNA样品是随机收集的，所以该统计方法适用。所研究的变量是分类变量，在分类变量的每个水平上，每类分类变量的期望频率计数至少为5。 零假设是H₀，它表示稀释DNA中的突变比例与操纵DNA中的突变比例相同。备择假设是H_a：它表示稀释DNA中的突变比例与操纵DNA中的突变比例不同.对于此分析，我们选择显著性水平α为0.05。卡方检验第一步是建立一个 2 × 2 列联表 (表1)。 用于从特定单元格的观察计数中计算期望计数的通用公式为 [(行总和×列总和)/总人数(表2)。 首先，计算自由度(df)。当一个样品与另一个样品进行比较时，自由度 = (列数 − 1)× (行数 − 1)。因此，此试验中的自由度为 1. 基于卡方检验与样本数据的均一性，我们计算了df，期望频率计数和卡方检验统计量。并基于卡方统计量和df计算P值。

表1：2×2 列联表的一般符号

	实验组DNA	对照组DNA	合计
突变	a	b	a+b
无突变	c	c	c+d
合计	a+c	b+d	a+b+c+d=n

表2：2×2 列联表中的期望频数的计算

	实验组DNA	对照组 DNA
突变	(a+b) (a+c)/n	(a+b) (b+d)/n
无突变	(a+c) (c+d)/n	(c+d) (b+d)/n

实验结果

我们共收集了187个拾取了DNA片段的AFM探针并进行PCR。由于单分子PCR效率低下，仅有22个样品被成功扩增并测序。同时，577份DNA样品(281份稀释DNA；296 份拉伸DNA) 作为对照组，并获得403份PCR和测序结果 (其中，180 份稀释DNA，223 份拉伸DNA)。

根据实验结果，我们发现基于AFM的单分子操纵导致了DNA突变率增加约70%。在使用稀释和拉伸DNA进行对照实验的情况下，突变率分别约为30％。

表3中给出了用于计算卡方检验的操纵与DNA突变之间的关联的数据。操纵DNA为实验组稀释DNA为对照组。卡方检验统计量可以有上述公式得出。参考表 4 和表5 进行计算。根据得出的卡方统计量和自由度，算出的P值为0.0002。统计检验结果在0.05水平上拒绝原假设即两比率相等。从而得出AFM操纵的DNA发生突变的概率与稀释DNA突变概率相比具有显著统计学意义。因此，AFM操纵可以有效提高DNA的突变率。这两个比例之间的差异的置信区间为(0.1983, 0.6451)。 根据以上统计分析结果我们得出AFM操作与DNA突变之间存在关联。

表3：用于计算卡方统计量的观察频数 (操纵 DNA vs 稀释 DNA)

	操纵 DNA	稀释 DNA	合计
突变	16	55	71
无突变	6	125	131
合计	22	180	202

表 4：期望频数 (操纵 DNA vs 稀释 DNA)

	操纵 DNA	稀释 DNA
突变	(71×22) / 202 = 7.732673	(71 × 180) / 202 = 63.26733
无突变	(131 × 22) / 202 = 14.26733	(131 ×180) / 202 = 116.7327

表5：计算卡方统计量的汇总数据

观察频数( )	期望频数 （ ）
16	7.732673	68.3487	8.8390
55	63.26733	68.3487	1.0803
6	14.26733	68.3487	4.7906
125	116.7327	68.3487	0.5855
			13.501

当然，我们也可以用R来计算卡方统计量：

M <- as.table(rbind(c(16, 55), c(6, 125)))

dimnames(M) <- list(outcome = c("Mutations", "Non-Mutations"),

Treatment = c("Manipulated DNA","Diluted DNA"))

(Xsq <- chisq.test(M))

优势比 (OR) 计算如下：

OR值为 6.06 表明AFM操纵的DNA突变率比稀释DNA高约6倍。 我们知道AFM操纵DNA的过程可以大致分为两个步骤：第一步，通过“分子梳”技术将稀释后的DNA分子拉伸到APTES修饰的云母[17]表面上[13, 16]；第二步，AFM对DNA进行成像和操纵。那么，是哪一步诱导了DNA突变呢？

比较拉伸DNA和稀释DNA的突变率卡方统计量为0.477如表 6所示， df = 1。根据卡方统计量和自由度得出P 值为 0.4898。因此，不能拒绝原假设，在0.05水平上两样本的突变率是一样的。即拉伸DNA和稀释DNA的突变率的不同没有显著统计学意义。

表6：用于计算卡方统计量的观察频数 (拉伸DNA vs 稀释 DNA)

	拉伸DNA	稀释 DNA	合计
突变	62	55	117
无突变	168	125	293
合计	223	180	410

比较操纵DNA和拉伸DNA的突变率卡方统计值如表 7所示，统计量为 17.599 (df = 1)。根据卡方统计量和自由度得出P 值为 0.0001。由于P>α=0.05。拒绝原假设，结果表明操纵DNA的突变率与拉伸DNA突变率之间存在显著差异。操纵处理对DNA突变有效，在实验中起着最重要的作用。

表7：用于计算卡方统计量的观察频数 (操纵DNA vs 拉伸 DNA)

	操纵DNA	拉伸DNA	合计
突变	16	62	78
无突变	6	168	174
合计	22	223	245

讨论

在该实验中，DNA突变的频率在操纵的DNA组中明显高于稀释的DNA或拉伸的DNA组。经稀释和拉伸处理的DNA样品之间未发现显着差异。突变率的增加表明，在操作过程中，机械力可能会对DNA分子造成某种损害，并导致PCR扩增后发生突变。此外，我们对DNA突变率拟合logistic回归

此公式中，p为 DNA突变率Y， p=(Y=1)； p/(1-p) 即比值； ， 是根据数据最大似然估计估计的回归系数。

回归结果如下：

基于这些结果，显着性水平为0.05时，操纵DNA与稀释DNA相比具有显着区别。然后我们得出结论，DNA操纵与DNA突变可能性的变化有关。这表明，如果DNA受AFM操纵，则DNA突变比稀释的DNA高约6.0倍。

在操纵DNA样本中的预测突变率为72.7%稀释DNA样本为30.6%。

并且我们得出了操纵DNA突变率与稀释DNA突变率相比较的的卡方检验的p值作为主要分析终点，操纵DNA突变率与拉伸DNA突变率相比较的的卡方检验的p值作为次要分析终点，同时得出了拉伸DNA突变率与稀释DNA突变率相比较的的卡方检验的p值。因此，由于我们做了三次比较，有可能增加I型错误。所以我们将3组一起在显著性水平为0.05的基础上做卡方检验。

我们可以用R来计算：

M <- as.table(rbind(c(16, 62,55), c(6, 168,125)))

dimnames(M) <- list(outcome = c("Mutations", "Non-Mutations"),

Treatment = c("Manipulated DNA", "Stretched DNA"，"Diluted DNA"

))

(Xsq <- chisq.test(M))

比较操纵DNA，拉伸DNA， 稀释DNA突变率的卡方统计量如表8所示，P值为5.147e-05。从而拒绝原假设，表明三种DNA样品突变率在0.05水平上有显著差异。也就是说，三组DNA样品中有一组或两组对DNA突变有效。

根据分析结果，操纵处理对DNA突变有效，在实验中起着最重要的作用。

表8：用于计算卡方统计量的观察频数 (操纵DNA vs 拉伸 DNA vs 稀释 DNA)

	操纵DNA	拉伸DNA	稀释DNA	合计
突变	16	62	55	133
无突变	6	168	125	299
合计	22	223	180	432

结论

我们给出了一种统计学方法-卡方检验用于比较两个（或多个）独立组之间的分类响应计数或计数。

本文用卡方检验方法来检验DNA突变率在纳米操纵DNA，拉伸DNA，稀释DNA中是否存在显著差异，得出在0.05水平上纳米机械力操纵DNA可以增加DNA突变率。

通过分析每个过程中的突变结果，探索由机械力引起的非随机突变的可能性将非常有趣。

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