人肌腱干细胞的分离与鉴定

许华亮

广东药科大学附属第一医院骨科，广东广州 510080

间充质干细胞是一种中胚层来源、具有高度多向分化潜能的成体干细胞，分布于全身结缔组织及器官间质，在特定的条件下可分化为脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌腱细胞和肌细胞^[1]。最早发现从骨髓中提取出间充质干细胞，除此之外，学者们还从脂肪、脐带、牙髓、滑膜以及骨骼肌等组织中分离得到间充质干细胞^[2]。

传统的观点认为，肌腱细胞是唯一存在于肌腱组织中的细胞类型。然而，很多肌腱组织的标本中出现骨样组织，暗示了其中可能存在一种多向潜能细胞，在某些条件下能发生成骨分化。肌腱干细胞的发现是这一猜测的有力验证。这种细胞首先由Bi等命名为肌腱干细胞^[3]，随后学者们也从小鼠、人和兔子肌腱组织中提取出类似的细胞^[4]。

肌腱干细胞兼备肌腱细胞和干细胞的某些性质，亦有差异。肌腱细胞、肌腱干细胞均属于特异性成熟细胞，前者已失去多向分化的潜能，以及不能表达干细胞标志物。由于容易取材和分离的优势，间充质干细胞已经作为种子细胞，广泛应用于组织工程中^[5]。但Tan等^[6]的研究表明，肌腱干细胞比骨髓间充质干细胞有着更好的克隆能力、更快的增殖速率、更高的表达肌腱相关基因，可能在成骨等多向分化方面更有优势。肌腱干细胞本身来源于肌腱组织，它的研究有利于理解肌腱炎、肌腱钙化以及腱骨愈合等人类肌腱组织相关疾病，有利于肌腱修复寻找合适的种子细胞。

1 材料与方法

1.1主要试剂

0.25%胰蛋白酶、I 型胶原酶、Lg-DMEM 培养基、澳洲胎牛血清FBS 、青霉素-链霉素双抗等。

1.2细胞分离与培养

本实验已通过广东药科大学附属第一医院伦理委员会的同意，遵循医学伦理标准。采用胶原酶消化法联合低密度接种法提取肌腱干细胞。肌腱干细胞的提取方法为：取自肌腱重建手术后剩余的肌腱组织块，去除肌肉、筋膜、腱鞘等组织，留取腱性组织。首先用0.25%胰蛋白酶预消化，然后用含胎牛血清的低糖培养基加入其中终止消化，剪碎肌腱，用Ⅰ型胶原酶消化。接着过滤、离心及计数细胞，采用Lg-DMEM 完全培养基接种、培养及传代。

1.3肌腱干细胞的鉴定

1.3.1细胞克隆形成能力观察

将原代细胞以50、100、200个/平方厘米接种于6孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养，7天后行结晶紫染色，计算直径>1毫米的克隆数。正置显微镜观察克隆形态。

1.3.2干细胞表面标志物检测

将5×10⁵个第6代细胞于1μg PE 或FITC标记的CD29、CD90、CD45 、CD44抗体中室温孵育45分钟，PBS洗1 次，12000g 离心5分钟，重悬于300μL预冷的PBS中，荧光激活分选分析。采用流式细胞仪程序计算阳性表达细胞百分率。PE 或FITC 标记同型匹配的IgG1 作为阴性对照。

1.3.3多向分化能力鉴定

将第2代的细胞悬液以5000个/平方厘米的密度接种6孔板中，待细胞完全融合后，加入成骨或者成脂诱导液诱导培养，每3天换一次诱导液，完全培养基培养的细胞作为对照组。14天后，4%多聚甲醛固定，成骨诱导行茜素红S染色，成脂诱导行油红O染色。

2 结果

2.1形态的观察

接种2小时后观察到细胞开始贴壁，1天后可见细胞呈现梭形，大小大致均一，为间充质干细胞典型的形态。在1周左右细胞逐渐增多。传代培养后可呈旋涡状生长的细胞；当细胞融合率较高时，呈鹅卵石样排列。

2.2克隆形成能力的观察

培养3周后，结晶紫染色后，计数形成的克隆，克隆形成的标准为直径＞2毫米均。观察的结果是，0.8%-1.2%的细胞出现形成克隆。

2.3干细胞表面标志物的检测

为判断分离培养的细胞是否具有干细胞特性，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物表达率。干细胞表面标记物CD105、CD44的阳性表达细胞百分率为超过99%和92%，造血系统表面标志物CD14、CD45的阳性表达细胞百分率只有0.10% 和0.25%。

2.4多向分化能力的观察

成骨诱导3天即出现钙盐沉积，2周后可见多个钙盐结节形成。成脂诱导1周后，观察到细胞胞浆内出现细小脂滴，相互融合并逐渐增大，诱导2周可观察到脂滴形成，3周后经油红O染色可观察到细胞内的橘红色的脂肪滴。

3 讨论

本实验成功地从人的肌腱组织中提取出一群特殊细胞，这些细胞具备干细胞特性，包括干细胞的克隆能力、阳性表达干细胞表面标志物以及具有多向分化的潜能。

肌腱干细胞是一种成熟的干细胞，在一定条件或者干预下可分化为肌腱细胞和非肌腱干细胞，后者包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。与肌腱细胞比较，肌腱干细胞在形态、增殖潜力和干细胞特异性方面均不同。它形态呈鹅卵石状，有较大的细胞核^[7]。国际细胞治疗协会在2006年就提出了人类间充质干细胞的定义与标准。在这些标准中，95%以上的分离细胞应表达CD105、CD73和CD90，只有不到2%的细胞应表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA-DR

^[8]。因此，本实验的肌腱干细胞符合国际细胞治疗学会对间充质干细胞的标记要求。

本实验中从肌腱组织提取的细胞，绝大部分细胞为大小均一、梭形的贴壁细胞，符合典型的间充质干细胞形态，且具有干细胞的克隆能力。实验中还发现成骨诱导3天出现钙盐沉积；成脂诱导1周出现小脂滴，验证了其具有向骨细胞、脂肪细胞分化的潜能。

肌腱干细胞仍保留了组织特异性分化能力，这使其在肌腱相关疾病和腱骨愈合研究中，与其它干细胞相比更具有优势，主要表现在：①与同种系的骨髓间充质干细胞比较，鼠肌腱干细胞中高表达基因Scx，Comp，Sox9和Runx2、人肌腱干细胞中高表达蛋白TNMD；②肌腱干细胞具有更优的克隆能力、更快的增殖速度^[9] ；③成骨分化方面，肌腱干细胞更有优势，人和鼠肌腱干细胞钙离子积累速度是骨髓间充质干细胞的4倍。

4 结论

本实验成功从人肌腱组织中提取出干细胞，经培养与鉴定，是肌腱干细胞。肌腱干细胞的研究有利于理解人类肌腱组织相关疾病和腱骨愈合，有望成为肌腱修复组织工程种子细胞新的选择。

参考文献：

[1]赖凡, 唐康来. 细胞学方法促进腱骨愈合研究进展[J]. 中国运动医学杂志, 2015, 34(009):905-909.

[2]Giselle, Chamberlain, James, et al. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells: Their Phenotype, Differentiation Capacity, Immunological Features, and Potential for Homing[J]. Stem Cells, 2007.

[3]Bi, Y., et al., Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine, 2007. 13(10): p. 1219.

[4]Zhang, J., T.Y. Pan and J.H. Wang, Mouse treadmill running enhances tendons by expanding the pool of tendon stem cells (TSCs) and TSC-related cellular production of collagen. Journal of Orthopaedic Research, 2010. 28(9): p. 1178-1183.

[5]Pittenger, M.F., et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999. 284(5411): p. 143-147.

[6]Tan, Q., P.P.Y. Lui and Y.F. Rui, Effect of In Vitro Passaging on the Stem Cell-Related Properties of Tendon-Derived Stem Cells—Implications in Tissue Engineering. Stem Cells & Development, 2012. 21(21): p. 790-800.

[7]Thampatty B P , Wang H C . Mechanobiology of young and aging tendons: In vivo studies with treadmill running[J]. Journal of Orthopaedic Research, 2017.

[8]Dominici M , Le Blanc K , Mueller I , et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4):315.

[9]Tan, Q., P.P.Y. Lui and Y.F. Rui, Effect of In Vitro Passaging on the Stem Cell-Related Properties of Tendon-Derived Stem Cells—Implications in Tissue Engineering. Stem Cells & Development, 2012. 21(21): p. 790-800.

△基金项目：广东省中医药局项目（编号：20191204）