结核感染T细胞斑点试验影响临床因素分析

杨朝生 陈慧 邓玉光 * 张东伟 邓玉光

（柳州市人民医院，广西 柳州 53500）

摘要： 目的 探讨结核感染T细胞斑点试验的临床影响因素 方法 收集2015年7月至2018年7月检测结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT）60例诊断肺结核患者,分别从年龄、性别、基础疾病、免疫状态（CD4计数、影像学等方面分析T-SPOT的临床影响因素。结果 男性T-SPOT阳性率低于女，但是无统计学差异；而合并糖尿病患者阳性率明显低于非合并患者，有统计学差异（P＜0.05）。 CD4<200／μl组中的阳性率高于CD4>200μl，但差异无统计学差异(P>0．05)；A 孔或者 B 孔（T-SPOT数值）不同病变范围的肺结核患者之间比较差异有统计学差异（P＜0.05），范围重度者T-SPOT数值明显低于轻、中度者，有统计学差异（P小于0.05）。结论 T-SPOT 受复杂的临床因素影响较小，有很好的灵敏度并且能很好的反应病情严重程度，因此可以广泛的应用于肺结核的诊断及评估。

关键词 ：肺结核 结核感染T细胞斑点试 影响因素

由于结核菌复杂的生物学特性,导致结核病的诊断复杂,易误诊、漏诊。我国为肺结核发病率最高的国家之一，许多未经规律治疗的肺结核患者最终走向严重肺功能障碍，造成家庭及国家的重大负担。近年来,我国肺结核发病率呈明显上升趋势,而常用诊断结核的结核菌素试验(TST)诊断活动性肺结核的价值有限,易漏诊^[1],目前实验室的结核检测方法虽然有PPD试验、MTB-Ab、涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养等多种方法，但这些方法都有很大的局限性。 PPD试验与接种的卡介苗(BcG)存在交叉反应，特异性低；涂片及MTB-Ab检测敏感性较低；结核分枝杆菌培养虽然是TB诊断的金标准，但存在着培养周期太长的问题，不利于快速诊断和早期治疗。 因此，探索出一种快速有效的TB诊断方法已是当务之急。近年来发展的T-SPOT是通过检测人体内分泌IFN-γ的MTB(结核分枝杆菌)抗原特异性Ｔ淋巴细胞来判断是否存在MTB感染，国外报道，T-SPOT的灵敏度和特异度 分别为89.%和98.1%^［2］ 。该诊断技术在我国尚未上市且尚未有较大规模的临床应用评估，本研究拟对其临床影响因素进一步深入探讨分析。

1  对象与方法

1. 1. 研究对象 2015年7月至2018年7月我院检测结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT）60例诊断肺结核患者，诊断或初治＜2 周的菌阳和菌阴活动性肺结核患者，（52.57±12.26）男34例，女26例，其中28例合并糖尿病，其余32例未合并糖尿病。痰抗酸杆菌涂片阳性 21例，阴性39例，经培养证实所有阳性者为结核分枝杆菌感染，所有阴性肺结核诊断符合 2001 年中华医学会结核病学分会 制订的《肺结核诊断和治疗指南》^[3]

   2. 方法

   3. 1.2.1 标本采集 采集研究者外周静脉血 8ml，加人含枸橼酸钠的 CPT 血管内，18℃，1600g 离心 28min，将单个核细胞层从 CPT 管中转移到新的干无菌 15ml 尖底 离心管中，加入 10ml AIM-V 培养液，18℃， 600g 离心 7 min，离心后小心去除上清液，加入 1ml AIM-V，轻缓重旋细胞沉淀，加入 AIM-V 培养液至 10ml，18益 350g 离心7min。离心后小心弃去上清液，加入 0.7ml AIM-V 培养液重悬细胞。将混匀的细胞悬液稀释后进行计数，根据计数结果调整细胞悬液浓度为 2.5*10⁶/ml 。

1.2.2 T-SPOT测定 采用酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）， 选用英国 Oxford ImmunotecLtd．生产的结核感染 Ｔ 细胞检测试剂盒，按照使用说明操作六部法。 首先外周单个核细胞（PBMCs）分离制备，单个核细胞洗涤和计数制备工作浓度细胞悬液， 将细胞悬液和抗原加入微孔培养板，37℃,5%CO₂培养过夜， 洗涤微孔板并加入酶标抗体，洗涤微孔板加入底物反应液，最后斑点计数。

1.2.3 结果判定 根据抗原 A 或/和抗原 B 孔的反应判断结果：判断标定^[7] :① 如阴性对照孔显色点数0-5个,检测孔(抗原A孔或者B孔)显色点数减去阴性对照孔显色点数≥6,为阳性。② 如阴性对照孔显色点数≥6 个,检测孔(抗原A孔或者B孔)显色点数超过阴性对照孔显色点数2倍,为阳性。每例患者血液标本均通过该检测方式得到T-SPOT数值。

1.2.4 T细胞亚群 抽取两组患者外 周静脉血2 mL，采用流式细胞仪测定其中T细胞亚群水平，主要是CD4，并根据CD4计数分为＜200／μl组及>200／μl组，比较两组TSPOT阳性率有无统计学差异。

1.2.5 肺部 X 线检查确定病变范围^[4]：分为轻度 17例，中度24例，重度19例，肺部有空洞病变25例，无空洞者35 例。

１．３ 统计学处理

应用 ＳPSS 13.0软件，分别采用 χ２ 检验对各组率进行统计学分析。A孔和比孔数值的比较则采用t检验。 P ＜０.０５ 为差异有统计学意义。

2  结 果

2.1 性别、糖尿病T-SPOT表现比较 研究对象年龄16岁-91岁之间，平均年龄（52.57±12.26）男34例，女26例，其中28例合并糖尿病，其余32例未合并糖尿病。男性阳性率低于女（75%VS82.1%），但是无统计学差异（x2= 0.449，P>0．05）；而合并糖尿病患者阳性率明显低于非合并患者（57.1%VS83.8%），有统计学差异（x2= 0.449，P<0．05）。

表1.不同人群（性别）TSPOT.TB表现比较

一般项目 阴性例数 阳性例数 阳性率（%）

男 8 24 75 女 5 23 82.1

表2.不同人群（糖尿病）TSPOT.TB表现比较

基础病 阴性例数 阳性例数 阳性率（%）

糖尿病 12 16 57.1 非合并糖尿病 5 27 83.8

2.2 CD4细胞计数水平对T SPOT检测验检出阳性率的影响 按CD4细胞计数水平高低 将有外周血CD4+T细胞绝对计数结果的60 患者分为CD4细胞计数<200／μl组及CD4 细胞计数>200／μl组，其中<200／μl组29例，>200／μ组31例。将这2组中的T SPOT检测阳 性率，结果见表1。统计学分析显示T SPOT检测在 CD4<200／μl组中的阳性率高于CD4>200,（75.9％对64.5％)，但差异无统计学意义(x2= 0.918，P>0．05)；

表3：两组CD4细胞计数患者的TSPOT阳性率比较

CD4细胞分组 阴性例数 阳性例数 阳性率（%）

≤200／μl 7 22 75.9 >200／μl组 11 20 64.5

2.4 影像比较

肺结核患者不同病变范围的 T-SPOT.TB 比较。由表 3 可见，A 孔和 B 孔 SFCs 不同病变范围的肺结核患者之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；病变 范围重度者 A 孔 SFCs 低于轻、中度者（t=3.520、2.845， 均 P＜0.05），病变范围重度者 B 孔 SFCs 低于轻、中度 者（t=2.505、2.080，均 P＜0.05），病变范围轻、中度者比较A孔和B孔 SFCs 差异均无统计学意义（均 P＞0.05）。

表4.肺结核患者不同病变范围的 T-SPOT.TB SFCs 比较

病变范围 n A 孔SFCs B孔SFCs

轻度 18 94.32±23.46 106.33±72.56 中度 28 73.12±16.45 105±95.61 重度 14 28.34±8.49 45.63±25.33

F 7.283 3.289 P 0.001 0.042

3 讨论

肺结核是我国常见病，多发病，据WHO统计,全球有约18.6亿人感染结核分枝杆菌 (mycobacterium tuberculosi,MTB), 每年新发患者约89万。我国结核病年发病例 100万,发病率7 8/10 万[5]。 临床过程中，肺结核诊断常依赖于痰涂片、影像学、PPD等。上述诊断受年龄、基础疾病、免疫、疫苗接种等影响，表现常不典型，呈多样性。例如国内报道HIV／ AIDS患者中PPD试验阳性率为9.8％～12.5％， CD4<200／μl时PPD均无反应，CD4>200／μl时有部分强阳性反应^[6]；痰涂片则阳性率普遍较低，敏感性差。另外痰菌阴性的肺结核患者占结核病 患者的 60%-70%,且标本细菌含有的数量对其也产生较大影响^[7]。另外，对比研究2004-2013年统计结核培养阳性率（35.6 ± 3.4）%，非结核分枝杆菌感染阳性率从4.5％至9.4％，有逐年上升趋势^[8]，从而提示非结核分支杆菌感染亦会对诊断肺结核影响逐渐增大。

T-SPOT 外周血检测技术是近年来由酶联免疫斑点技术发展起来用于检测结核感染的一项实验室检测新技术,其原理是人体感染 TB 杆菌 后可产生记忆性 T 淋巴细胞,当再次接受 TB 杆菌 抗原刺激后,记忆性 T淋巴细胞可迅速增殖为效应性T淋巴细胞,并分泌 INF-7,通过检测可分泌 INF- 7 的 T 淋巴细胞数目,判断机体是否感染 TB 杆菌, 目前已成为欧洲国家筛查肺结核的主要方法。 目前尚缺乏对其所影响的临床因素评估缺少综合评估。本研究提示本研究从性别、合并基础疾病、免疫情况及影像学几个方面进行了综合评估。

有流行病学显示无论是网络直报系统还是结核病专报系统登记报告的肺结核患者，其分布特征均表现为男性高于女性，张威等^[9]研究显示，男性老年不典型肺结核患者合并肺部感染(34.1％)和心功能不全(26.9％)比女性高，本研究提示男性阳性率低于女性，但是并未统计学差异，提示性别并未影响T-SPOT对肺结核诊断敏感度。而TB是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者易合并的机会性感染之一，临床研究结果显示，DM患者结核病患病率为非DM患者的3-6倍，且血糖控制不良DM患者的结核病发病率为血糖控制良好DM患者的3倍^[10]，本研究提示对于合并糖尿病患者阳性率明显低于非合并非糖尿病患者，且两者有统计学差异，考虑DM合并TB患者免疫功能下，其机体变态反应与免疫应答受到显著抑制，从而减弱结核菌素反应有关，上述说明合并糖尿病肺结核患者使用TSPOT诊断肺结核时，需要寻找更多依据辅助诊断。

免疫功能低下易合并结核病的常见原因，如长期或大量使用糖皮质激素、恶性肿瘤放化疗后、糖尿病或艾滋病等。与免疫正常宿主相比，免疫低下患者并发肺结核时其临床症状往往隐匿和不典^[11],一般结核病结核菌素试验阳性率多在90%以上，而免疫低下结核患者的阳性率仅15％-40％，特别是AIDS患者的结核菌素试验常假阴性从而给诊断带来困难。CD4数量高低可一定程度反映宿主免疫情况，当CD4+ 细胞≤200/μl时，结核菌容易在体内大量繁殖播散。研究提示CD4+ 细胞≤100／μl时组结核菌素试验阳性率仅为11.3%^[12]，本研究中当CD4+ 细胞≤200/μl时,T-SPOT阳性率仍可达到75.9%，与>200／μl组相比并无统计学差异，提示使用T-SPOT诊断肺结核时并不受患者免疫状态影响，可以做独立诊断依据用。

肺结核患者建立肺结核的影像学-病原学- 免疫学诊断系统对于判断肺结核病情疗效观察上有重要意义，本研究还观察、分析了T-SPOT表现与胸片之间的关系，研究提示不同病变范围的肺 结核患者之间比较差异有统计学意义（P＜0.05），重度患者的点值明显低于轻中度患者，上述说明T-SPOT.TB 可作为肺结核严重程度及临床

预后评估的免疫学检测手段。

综上所述，T-SPOT能够准确的反应疾病的严重程度，且其阳性率表现受患者性别、免疫状态等无明显影响，可以广泛应用于肺结核的诊断、病情评估、转归判断等。但患者合并糖尿病基础时，需要注意结合其他的诊断手段：如病史、PPD（结核菌素试验）、影像学等综合判断。

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课题基金：1.广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题（Z20180327）2.柳州市院内立项课题 （lry201908）