尿液标本保存时间对巨细胞病毒 DNA检测的影响研究

汪衍民

山东省菏泽市立医院检验科　 274031

【摘要】目的：研究不同尿液标本保存时间给巨细胞病毒DNA检测带来的影响。方法：采集本院自2015年8月至2016年8月期间纳入的32份不同水平含量巨细胞病毒DNA检测阳性标本,包括高载量巨细胞病毒DNA检测阳性标本、中载量巨细胞病毒DNA检测阳性标本、低载量巨细胞病毒DNA检测阳性标本，保存于4℃环境下3天、7天、14天，均予以巨细胞病毒DNA检测。结果：在此次纳入分析32份尿液标本检测中均可成功检测，显示检测中不发生假阳性与抑制的现象，在第0、3、7、14天所有样本的总体检测情况均不发生明显下降或者上升的趋势，存在可靠的稳定结果，但在不同尿液标本保存时间下采取t检验方式处理所有样本,巨细胞病毒DNA载量之间，P＞0.05，统计学差异并不显著。结论：保存于4℃环境下3天、7天、14天尿液标本的巨细胞病毒DNA检测载量不发生显著降低与上升的现象，具有稳定可靠的结果。

[abstract] objective: to study the effect of the preservation time of different urine specimens on the DNA detection of cytomegalovirus. Methods: collected in our hospital from August 2015 to August 2016 in 32 different levels of content during CMV DNA testing positive specimens, including high loads CMV DNA testing positive specimens, loads of CMV DNA testing positive specimens, low loads cytomegalovirus DNA tests positive specimens, save 3 days in the condition of 4 ℃, 7 days, 14 days, both CMV DNA testing. Results: in the included in the analysis of 32 urine samples could be successfully tested, according to tests does not occur the phenomenon of false positives and inhibition, in 0, 3, 7, 14 days of the overall testing of all samples are not apparent falling or rising trend, there is stable and reliable results, but under different urine specimens preserved time t test ways to handle all samples, between cytomegalovirus DNA loads, P > 0.05, there is no significant statistical difference. Conclusion: save 3 days in the condition of 4 ℃, 7 days, 14 days urine specimens of CMV DNA testing loads without significantly reduced with rising phenomenon, has a stable and reliable results.

【关键词】尿液标本保存时间；巨细胞病毒DNA；检测影响

人巨细胞病毒感染是因人类疱疹病毒β亚科导致的疾病，普遍存在于自然人群中，尤其是婴幼儿，在婴幼儿发生先天性巨细胞病毒感染之后可能对患儿身体器官组织造成影响^[1-2]，大约有10~15%的无症状感染患儿发生耳聋、智力迟缓等损害,所以，需要尽早诊断婴幼儿的巨细胞病毒感染。在与实时荧光聚合酶链反应检结合之后对巨细胞病毒含量检测的敏感性比较高，可进行准确的定量分析，在操作中还是会被试剂、人为、标本等因素所影响，不少实验室因采集流程、样本数量的限制，不能及时对标本进行处理，所以，需要进一步研究巨细胞病毒DNA的稳定性。现报道2015年8月至2016年8月期间纳入的32份不同水平含量巨细胞病毒DNA检测阳性标本分析结果。

1 资料与方法

基础资料

本次研究实验组数据选为2015年8月至2016年8月期间安如的32份不同水平含量巨细胞病毒DNA检测阳性标本，女性16例，男性16例，最大年龄3岁，最小年龄1岁，中位年龄为（2.11±0.32）岁。清洁患儿外阴。

方法

留取5~10ml患儿新鲜尿液，保存于无菌干燥管中进行送检，在4℃环境下保存剩余的检测样本，选择中山大学达安基因诊断中心研发的巨细胞病毒核酸扩增(PCR) 荧光定量检测试剂盒以及美国ABI公司研发的ABI－7500全自动PCR分析仪，引物序列包括R5＇一 GCTGAGTTCTTGGTAGAAGAAC一3＇以及 F5＇一 GCTAGACTATGCAGAGCATGTA 一3＇。选取尿液标本1ml放置在无菌离心管中,以每分钟12000转动速度进行5分钟的离心处理，去上清选取样本沉淀加入1ml灭菌生理盐水进行混合,之后以每分钟12000转动速度进行5分钟的离心处理，去上清，将DNA 提取液50ml 加入之后进行混合，在100℃恒温中进行10min处理,以每分钟12000转动速度进行5分钟的离心处理，备用。在遵守试剂盒相关说明书来实施 巨细胞病毒DNA检测.扩增条件包括93℃2分钟；93℃45s、55℃ 60S进行10个循环；93℃30S，55℃ ,45S进行30个循环，检测过程中每次检测都包括阴性、阳性、空白、对照的不同浓度样本，以此分析是否发生假阳性或者抑制现象。

2 结果

在此次纳入分析32份尿液标本检测中均可成功检测，显示检测中不发生假阳性与抑制的现象，在第0、3、7、14天所有样本的总体检测情况均不发生明显下降或者上升的趋势，存在可靠的稳定结果。在不同尿液标本保存时间下采取t检验方式处理所有样本,巨细胞病毒DNA载量之间，P＞0.05，统计学差异并不显著。第0d与第14d巨细胞病毒DNA 载量之间存在的相关性比较好（r²=0.911，P＜0.05）。第0d与第3d巨细胞病毒DNA 载量之间（P=0.9015，t=0.1254）；第0d与第7d巨细胞病毒DNA 载量之间（P=0.3613，t=0.9333）。

3 讨论

研究数据显示，在人群中巨细胞病毒感染比较普遍，尤其是婴幼儿，潜伏性感染与先天性感染为主要形式，会严重威胁婴幼儿的健康，因此早诊断以及早治疗十分关键。巨细胞病毒存在于患儿的尿液以及血液中，巨细胞病毒存在嗜上皮细胞的特性^[3]，十分容易将肾小管上皮细胞感染，相比较血液样本，尿标本均存在较高阳性率，尿液标本具有无创、取材方便等优势，十分容易被患者与家属所接受。所以，巨细胞病毒DNA 检测婴幼儿尿液，对于判断婴幼儿巨细胞病毒感染的意义十分重要。现在不但需要了解婴幼儿巨细胞病毒感染的临床相关症状，也也需要予以适当的实验室诊断。在诊断婴幼儿巨细胞病毒感染中病毒分离属于金标准，但是因分离病毒时间相对比较长，需要较高条件，存在较多影响因素，临 床实验室检测存在极大限制^[4]。本次研究显示，在不同尿液标本保存时间下采取t检验方式处理所有样本,巨细胞病毒DNA载量之间，P＞0.05，统计学差异并不显著。Real－timePCR检测技术实际上是依据多次扩增循环来对多个数据进行收集构建实时扩增曲线，以便于对 CT值进行确定，最后获DNA拷贝的起始数，达到准确定量分析的目的，存在结果直观、特异、定量、灵敏等优势，属于检测巨细胞病毒感染临床常用措施。临床实际操作过程中不少实验室因存在较少的检测样本数量或者不充足的实验人员人手或者不合理的操作流或者不能每天进行样本的的检测，进而实验室往往需要集合相应数量样本之后进行巨细胞病毒DNA的检测^[5]。此外，不少实验室并没有实行病毒DNA的检测，且实施巨细胞病毒DNA检测过程中需要将标本只能能够进行检测的实验室，进而影响检测整体结果。所以，分析不同保存时间给巨细胞病毒DNA检测结果带来的影响十分重要，以便于保证巨细胞病毒载量结果的重复性以及准确性。如果不能及时进行尿液标本检测巨细胞病毒DNA，可在14天之内的进行集中的巨细胞病毒载量处理，依据实际情况或者临床有疑问的结果分析之后，将不可测因素排除，于14天之后重复进行检测，可获得可靠且可信的检查侧结果，同时也应该保存在4摄℃环境下处理激将外送的样本，且确保2周之内间样本送到具有检测标准的实验室，以便于获得稳定可靠的检测结果^[6]。

参考文献：

[1]李文瑞, 叶敏南, 彭琪,等. 461例高胆红素血症新生儿尿液及母乳人巨细胞病毒DNA 结果的回顾性分析[J]. 国际检验医学杂志, 2016, 37(8):1037-1038.

[2]张玲, 张清禄. 不同保存时间对血浆标本中人巨细胞病毒载量的影响[J]. 检验医学与临床, 2015(20):3078-3079.

[3]谢丽, 易珍, 王建,等. 存储时间对血浆中巨细胞病毒DNA稳定性的影响[J]. 实用医学杂志, 2014(7):1151-1153.

[4]王敬衍, 程丽敏, 钱冬萌,等. 不同标本巨细胞病毒DNA检测在小儿巨细胞感染中的应用[J]. 世界最新医学信息文摘:连续型电子期刊, 2016, 16(80):131-132.

[5]毕昊, 余琴, 余谨,等. 全血标本离心前不同保存温度与时间对巨细胞病毒核酸检测结果的影响[J]. 中国输血杂志, 2016, 29(11):1243-1245.

[6]谢康, 刘艳秋, 阳彦,等. 母乳、小儿血液及尿液标本中检测巨细胞病毒对诊断小儿HCMV感染的临床应用[J]. 实验与检验医学, 2017, 35(3):340-343.