首乌藤的 UPLC特征图谱及多组分含量测定研究

周亚楠，白洁，刘永利

河北省药品检验研究院，河北石家庄 050011

目的：采用超高效液相色谱建立首乌藤的特征图谱, 并同时测定首乌藤中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷及蒽醌类成分的含量；分析市场上首乌藤的质量。方法：采用UPLC法，色谱柱：资生堂 C18（2.1×100mm，2.7μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；检测波长为254nm。结果：首乌藤特征图谱共有6个特征峰；含量测定中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚分离良好，在呈良好的线性关系；平均回收率分别为100.2%，98.0%，102.3%（n=9），RSD均在3%以内。结论：所建立的特征图谱与多成分含量测定方法能较好地反映首乌藤的整体质量情况。

关键词：首乌藤；特征图谱；UPLC；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；大黄素；大黄素甲醚

作者简介：周亚楠，女，出生年月：1983.08，籍贯：河北石家庄，毕业院校：河北医科大学，研究方向：中药质量分析研究，

UPLC specific chromatogram of polygoni multiflori caulis and determination of multi-component

ZHOU Yanan，Bai Jie，LIU Yongli

（Hebei Institate for drug control; Shijiazhuang050011, China）

Abstract: Objective To establish the UPLC specific chromatogram and determine 2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-O-glucoside and anthraquinones of polygoni multiflori caulis. To evaluate the quality of the commercial polygoni multiflori caulis. Method UPLC analysis was performed on a shiseido C18 (250mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was composed of 0.1% phosphoric acid and acetonitrile with gradient elution. And the Column temperature was35 ℃. The flow rate was 0.3 mL· min^-1 and the detection wavelength was 254 nm. Results The method for specific chromatogram was established,and there were 6 characteristic peaks in the characteristic chromatograms. The 2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-O- glucoside and anthraquinones component had good linearity in a certain range. The average recoveries were 100.2%，98.0%，102.3%, and RSD were less than 3.0%. Conclusion The specific chromatograms can be used to evaluate the quality of polygoni multiflori caulis. The specific chromatogram and contents of multi-component can be used for the quality contro1 of polygoni multiflori caulis reasonably and comprehensively.

Key Words: Polygoni multiflori; Specific chromatogram; UPLC; Determination of multi-component

首乌藤又名夜交藤，来源为蓼科植物何首乌Polygonummultiflorum Thunb．的干燥藤茎，秋、冬二季采割，除去残叶，捆成把，干燥，收载于《中国药典》2015年版一部，具有养血安神、祛风通络的功效

^[1]。近年来，对于何首乌的研究较多，而首乌藤的研究报道较少，我们针对目前药材市场上首乌藤质量参差不齐的现象，参照文献报道，并结合现行标准及首乌藤的化学成分^[2～4]，研究建立了其特征图谱，确立了6个特征峰，并对首乌藤中的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚3 种成分进行了含量测定，为了更好评价其质量提供了依据。

1试药与仪器

Thermo超高效液相色谱仪、PDA检测器；Millipore纯水器；资生堂 C18（2.1×100mm，2.7μm），Metiler AE163电子天平。大黄素（批号110756-200110），大黄素甲醚（批号1170858-200610），2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号110844-201411），首乌藤对照药材（批号120939-200605）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。样品：首乌藤饮片23批，来源于零售企业、批发企业、饮片生产企业及医疗单位等。

2 溶液制备

2.1混合对照品溶液

取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚对照品适量，分别加甲醇适量溶解并稀释制成含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.06044mg/ml、大黄素0.01649mg/ml、大黄素甲醚0.01619mg/ml的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液

取本品内容物0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤过，取续滤液，即得。

2.3对照药材溶液

取首乌藤对照药材0.5g，与“2.2”项下方法制备。

3 色谱条件

色谱柱：资生堂 C18（2.1×100mm，2.7μm）；流动相：以乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B）为流动相；梯度洗脱（0→10min，10%→30%A、90%→70%B；10→18min，30%→55%A、70%→45%B；18→23min， 55%A、45%B；23→30min，55%→65%A、45%→35%B）；柱温：30℃；流速为0.3ml/min；进样量为10µl。检测波长为254nm。

4特征图谱

4.1 特征图谱的建立及特征峰指认

根据23批次首乌藤的特征图谱检测结果，共标定6个特征峰（图1）。经与对照品比对，确定样品特征图谱中1号峰为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，5号峰为大黄素， 6号峰为大黄素甲醚，以大黄素峰为参照峰，各特征峰相对保留时间分别为0.365,0.606,0.665,0.686,1,1.331。

根据国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004）”进行数据处理分析，设定首乌藤对照药材特征图谱（S₁）为参照图谱，计算23批样品与特征图谱的相似度（表1）。各批首乌藤与特征图谱之间相似度在0.75~0.92之间（图2）。

表1 不同批次首乌藤样品相似度结果

样品编号	相似度结果	样品编号	相似度结果	样品编号	相似度结果
1	0.980	9	0.903	17	0.889
2	0.975	10	0.874	18	0.922
3	0.912	11	0.998	19	0.941
4	0.875	12	0.931	20	0.878
5	0.984	13	0.892	21	0.996
6	0.923	14	0.916	22	0.841
7	0.781	15	0.993	23	0.923
8	0.930	16	0.933	/	/

图1 首乌藤UPLC特征图谱

图2 23批首乌藤UPLC色谱图

4.2 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图。以大黄素为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<0.4%，特征峰的相对峰面积的RSD<1.3%。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004）”进行评价，相似度为0.99，结果表明仪器精密度良好。

4.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、1、3、6、15、24h进样测定，记录色谱图。以大黄素为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间RSD<0.5%，相对峰面积的RSD<1.4%，相似度为0.98。结果表明，供试品溶液于24 h内测定结果稳定。

4.4 重复性试验

取同一批样品，平行制备5份供试品溶液，进样测定, 记录色谱图。以大黄素为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<0.4%，相对峰面积的RSD<1.8%，相似度为0.99。结果表明该方法重复性好。

5 三种成分的含量测定

5.1 系统适应性试验

按“3”项下色谱条件进行检测，以大黄素计算理论塔板数大于5000，分离度大于1.5。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图3。

A

B

图3 含量UPLC色谱图（A：混合对照品B：首乌藤样品）

1：2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、2：大黄素、3：大黄素甲醚

5.2 线性关系考察

　精密吸取混合对照品溶液1，2，5，10，15，20，30µl, 按“3”项下色谱条件分别进样测定。以进样量X(μg)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示3个成分线性关系良好，回归方程、相关系数和色谱峰参数见表2。

表2 3种成分的回归方程和线性范围

成分	线性方程	相关系数（r）	线性范围（µg）
2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷	Y=0.0072X-0.0053	0.9996	0.036～0.604
大黄素	Y=136.38X-0.0119	1	0.0082～0.5495
大黄素甲醚	Y=136.23X-0.1118	1	0.01079～0.2698

5.3 重复性试验

　 取首乌藤样品（批号为20141773），按“2.2”项下方法制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液各10µl，进行测定，记录峰面积，计算含量。结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚平均含量(n=6)分别为6.46mg/g，2.47mg/g，1.11mg/g，RSD分别为2.8%，2.3%，1.9%。

5.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、1、3、6、15、24h进样测定，结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.5%、1.4%、0.7%，表明供试品溶液在24h内稳定。

5.6 加样回收试验

　 取已知含量的样品（批号为20141773）粉末0.25g，共6份，精密称定，精密加入混合对照品溶液（2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.0666 mg·mL^-1，大黄素0.02748 mg·mL^-1，大黄素甲醚0.01079 mg·mL^-1）25 mL，按“2.2”项下方法同法制备供试品溶液，进样测定，计算平均回收率。结果三种成分平均回收率(n=6)分别为100.2% (RSD为2.9%)，98.0% (RSD为1.7%)，104.3% (RSD为2.3%)。

5.7 样品测定

取23批样品，按上述条件测定，结果见表3。

表3 不同批次首乌藤样品中三个成分的含量测定( mg/g )

样品编号	二苯乙烯苷	大黄素	大黄素甲醚
1	0.03	0.16	0.09
2	0.1	0.13	0.07
3	0.36	1.48	0.69
4	0.83	0.35	0.18
5	0.57	0.89	0.41
6	0.29	0.16	0.08
7	0.84	2.87	1.36
8	0.16	0.25	0.11
9	0.42	0.19	0.09
10	0.31	0.43	0.24
11	0.27	0.17	0.07
12	0.51	0.97	0.51
13	0.34	0.16	0.06
14	0.49	0.67	0.49
15	0.28	0.11	0.06
16	0.31	0.13	0.08
17	0.44	0.24	0.11
18	0.41	0.16	0.09
19	0.39	0.51	0.24
20	0.46	0.24	0.13
21	0.26	0.27	0.15
22	0.30	0.20	0.11
23	0.70	0.47	0.23

6 讨论

实验应用UPLC技术研究首乌藤的特征图谱及多组分含量测定，缩短了分析时间，减少流动相的消耗，方法快速、简便、可靠。

中药特征图谱既能有效地鉴别中药材的品种、真伪、产地等, 又可以通过主要特征峰的面积、比例、吸收峰的强度、相似度等量化指标检测药材的质量。通过比较各样本间色谱图的差异来反映样品化学成分间的差异^［5～7］，不同首乌藤炮制品特征图谱峰面积存在明显的差异，反映了首乌藤饮片内在的质量差别。

实验采用DAD 检测器作全波长扫描并结合以往研究，发现254nm 处各成分具有较好的紫外吸收，色谱信息丰富，大部分色谱峰得到极限分离且基线平稳。

本实验建立了不同首乌藤饮片的特征图谱，对其化学成分进行了比较分析，同时又对2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及大黄素甲醚进行了定量分析，经分析饮片中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量与蒽醌类成分含量呈正比关系，表明首乌藤不同饮片所具有的外观特征与其内在化学成分变化有一定联系，为合理的炮制首乌藤饮片提供一定的科学理论依据。

参考文献：

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