弥散性血管内凝血患者全血细胞组织因子活性改变的意义探讨

叶敏 孙家祥 李艳

德阳市人民医院 618000

[摘要] 目的：探讨弥散性血管内凝血（DIC）患者全血细胞组织因子（TF）活性改变的意义。方法：选取2014年9月-2016年9月在本院收治的59急性粒细胞白血病患者，划分为A~D四组，即：正常对照组（A组）37例，疾病组中经凝血检查确诊正常病例（B组）7例，1~2项凝血检查异常组（C组）20例，疑似DIC组（D组）。运用脂多糖（LPS）刺激的全血复钙时间，对血细胞TF活性（TiFaCR）进行检测，对全血凝固时间进行复钙检查，依据全血凝固时间缩短情况（△s），对促凝活性（TF-PCA）的强弱进行判断。结果：回顾性、描述性分析受检病例，得知DIC患者的TF-PCA为（95.1±68.5）△s，疑似DIC为（85.7±16.8）△s，正常组为（30.3±25.0）△s，上述比较差异显著（P＜0.05），TF-PCA抑制实验结果及TF-PCA检测结果显示，TiFaCR对TF-PCA测定，在特异性与灵敏性上较高。结论：DIC与疑似DIC患者经LPS刺激之后，其TF-PCA呈显著性增强，TiFaCR对DIC诊断、预后评价具有突出的临床应用意义与价值。

关键词：弥散性血管内凝血；全血细胞组织因子活性；全血细胞组织因子表达

Abstract: Objective: To investigate the changes of tissue factor (TF) activity in whole blood of patients with disseminated intravascular coagulation (DIC). Methods: From September 2014 September -2016 in 59 patients with acute myeloid leukemia in our hospital, pided into A~D four groups: normal control group (A group) 37 cases, diagnosed by blood coagulation disease group in normal cases (B group) 7 cases, 1~2 blood coagulation abnormalities group (C group) 20 suspected cases, DIC group (D group). The use of lipopolysaccharide (LPS) stimulated whole blood recalcification time of blood cells. The use of SPSS20.0 software test, the implementation of bivariate correlation processing. Results: Retrospective, descriptive analysis examined cases that patients with DIC TF-PCA (95.1±68.5) △s, DIC (85.7±16.8 suspected) △s, normal group (30.3±25) △s, the difference was significant (P<0.05). Conclusion: DIC and LPS in patients with suspected DIC after stimulation, the TF-PCA was significantly enhanced, TiFaCR diagnosis and prognosis of DIC has a significant clinical significance and value.

Key words: Disseminated intravascular coagulation; Whole blood tissue factor activity; Whole blood tissue factor expression

组织因子（TF）实为一种跨膜糖蛋白，其在人体凝血始动过程中发挥着关键性作用，对于其生理功能而言，亲和受体高，乃为活化因子VⅡ（FVⅡ）与凝血因子（VⅡ）的重要辅助因子，TF-VⅡa通过对X、FIX予以水解，造成凝血酶成为始动内、外凝血系统，此乃形成血栓的核心诱因^[1]。近些年来，经多方研究证实^[2-4]，血液当中的细胞TF表达增高高于正常时，乃为导致血栓的重要征兆，在妊高症、糖尿病及心脑血管疾病患者的血液当中的单核细胞表面TF表达呈现增强状况，此乃形成血栓的潜在性、关键性危险因素。至此，测定细胞TF活性，已然成为对血栓形成予以判断的关键途径。本次研究通过选取可能为弥散性血管内凝血的59例患者，对其实施TiFaCR检测，现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

选取来我院行健康体检且自愿献血的37例学生，其中男24例，女13例，年龄区间21~29岁，平均24.3岁，受检者经全面体检，未查出与血栓形成、出血等有关的各类病症，随即取静脉血，检测凝血功能及TiFaCR，检查前，均无药物服用情况。选取2014年9月-2016年9月在本院收治的59急性粒细胞白血病（AML）患者，其中男41例，女22例，年龄区间12~75岁，平均32.3岁，多用DA方法治疗AML患者，即阿醣胞苷q12×7d、柔红霉素60×3d，DIC患者多选用2000单位低分子量肝素钠q12h。全部病例DIC诊断均与全国第七届血栓止血会议所颁布的相关诊断标准相符。分组：正常对照组（A组）37例，疾病组中经凝血检查确诊正常病例（B组）7例，1~2项凝血检查异常组（C组）20例，疑似DIC组（D组，凝血检查≥3项，但与DIC诊断标准不相符者）11例，与DIC诊断相符病例（E组）22例。

1.2设备与试剂

选用设备有：Sysnex CA-7000全自动血凝仪（日本）；BOCA半自动血凝仪（中泰公司联合制造）；凝胶电泳分析系统（上海四星公司产）；Centrifuge5810R低温离心机（德国Eppendorf公司产）。试剂：DIC检测试剂均为商购（Dade Behring公司产）；TF途径抑制物（TFPI，ADI公司产）；脂多糖（LPS，ADI公司产）；抗TF荧光标记抗体（Atf-FSC，ADI公司）。

1.3实验方法

测定全血组织因子促凝活性（TF-PCA），自然静脉枸缘酸抗凝全血（抗凝剂与血质量比例1:9），将LPS加至抗凝全血，使之质量浓度维持在9µg/ml全血，另将等体积全血、咪唑缓冲液加至另一试管，以此来替代LPS，随即在测定试管当中加入300µl自然全血，另将35µl浓度为0.2mol/L的氯化钙溶液加入试管，运用Sysmex-7000血凝仪，对全血凝固时间进行测定，将经过刺激以及未经刺激的两试管（有剩余血液），均放置于37℃环境中水浴，分别在1、2、4、8与24h，采用上述方法对凝血时间进行测定，实验测定均进行2次，对于测定中所存在的时间差，则取均值，用TF-PCA△s表示最终结果。凝血检测抗凝血酶、纤维蛋白原（Fg）、APTT及DD二聚体（DD）。

1.4统计学分析

SPSS20.0处理本次研究所得数据，方差分析TF-PCA检测结果。行t检验，对TF-PCA浓度反应曲线实施两变量相关性处理，若经比较差异显著，则由P＜0.05表示。

2.结果

2.1患者与正常人TF-PCA△s的测定结果

2.1.1各组TF-PCA△s结果

C、D与E组TF-PCA△s相比于A、B组，差异显著（P＜0.05），C组较之D组与E组，差异不显著（P＞0.05），D组与E组比较，无显著性差异（P＞0.05），TF-PCA与D-D、APTT等变化程度无相关性。见表1。

表1 各组TF-PCA△s的测定结果（ ±s）

组别	例数	TF-PCA（△s）	APTT（s）	Fg（g/L）	D-D（mg/L）
A组	37	30.3±25.0	29.8±2.92	3.38±0.49	0.31±0.08
B组	7	45.9±14.0*	26.5±4.28	2.93±0.59	0.17±0.12
C组	20	57.4±27.8#&	26.1±4.20	2.77±1.34	0.32±0.30
D组	11	85.7±16.8△	23.8±2.99	2.43±1.31	0.79±0.29
E组	22	95.1±68.7△	31.7±11.7	1.90±1.27	0.78±0.34

注：与D组、E组相比，^*P＜0.05；与A组相比，^#P＜0.05；与D组、E组相比，^△P＜0.05。

2.1.2各受检组TF-PCA△s与其他检测指标的异常状况

将超出正常人组（ ±s）作为异常判断标准的界值，由表2可知，E组与D组TF-PCA，以及在其他方面的检测，在异常率上相比于其他各组，高于后者，由表1可知，C组、D组、E组相比于A组、B组，差异显著（P＜0.05），D组与E组无显著性差异（P＞0.05）。

表2 各受检组TF-PCA△s与其他检测指标的异常状况[例（%）]

组别	例数	TF-PCA	APTT	Fg	D-D
C组	20	9（45.0）	8（40.0）	6（30.0）	3（15.0）
D组	11	6（54.55）	7（63.64）	6（54.55）	10（90.91）
E组	22	13（59.09）	14（63.64）	21（95.45）	19（86.36）

2.1.3受检病例动态观察

经典型病例动态观察得知，TF-PCA与DIC病程的发展、预后之间存在紧密关联。如图1所示。

图1 典型病例动态观察TF-PCA变化情况

注：例1—DIC治疗后好转，例2—抗血病治疗过程中出现DIC，经治疗后得以好转，例3—DIC治疗无效并死亡。

2.2 TF-PCA实验的特异性及影响因素分析

2.2.1全血细胞TF-PCA抑制实验分析

取2只抗凝全血，将LPS加入，另一只5ng/ml的TFPI加入其中，另一只则加入缓冲液，于37℃水浴温育，时间为3h，对凝血时间进行测定，最终结果得知，没有TFPI加入的试管，其凝固时间为（80.5±34.0）△s，而对于加TFPI的试管，则为（59.0±32.3）△s，两组比较差异显著（P＜0.05），由此得知，促凝活性存在部分被抑制状况。

2.2.2TF-PCA浓度反应曲线

适量取丙酮对人脑浸出液进行处理，对其进行调整，使之维持在正常血浆范围内，于12.0~12.5s凝固，设定其TF活性单位，即100%。依据1:16~256比例，稀释此TF溶液，将抗凝全血加入，另将0.2mol/L氯化钙溶液加入，对凝固时间进行记录，经半对数直线回归显示得知，TF-PCA与两管TiFaCT在差值方面具有紧密的相关性（r=0.915，P=0.028）。

3.讨论

3.1DIC诊断中TF-PCA改变的意义

部分研究指出，患者血液当中的粒细胞表面组织因子存在高表达状况，乃是机体内凝血被激活的突出表现与核心机制。通过对细胞TF开展深入研究得知，基于病理框架下，诸如细胞因子、内毒素等，对于单核细胞表达TF，均具有诱导作用，尤其是脂多糖（LPS），对于单核细胞高表达TF，具有突出的诱导作用，并且在促凝活性方面也比较显著，此点已得到临床研究证实^[5]。另与报道指出^[6]，静息血小板相应TF抗原，以α颗粒以及开放管道系统存在较多，如若血小板处于活化状态，TF发生易位，其中的部分则携带有些许的TF微粒，以一种载的方式，向血浆中发射。当前，大多研究未能于体外，诱导粒细胞，使之出现蛋白表达与TF mRNA，对于用作推测粒细胞上的相应TF，同样可能从中得到其他细胞，这些细胞还可能在的肿瘤细胞可表达TF中不断循环，进而形成持续性、不间断的TF-PCA。经本次研究得知，受检的急性白血病患者当中，多数均存在不同程度的凝血指标异常状况，另外，还有部分患者存在TF-PCA增高状况，其在整个疾病组所占比重为52.54%（31/59），其中增高最为明显的是DIC与疑似DIC组，其在整个总阳性例数当中所占比重为54.84%（17/31），通过开展凝血相关检查，得知正常组与轻微异常组（B组、C组）的异常率为32.26%（10/31），正常组（A组）异常率则为6.45%（2/31）。C组、D组与E组的TF-PCA相比于A组，存在显著性差异；C组与D组、E组相比，同样存在显著性差异，AL患者通常会出现凝血功能异常，还会并发DIC，已有诸多研究与报道所证实^[7]，尤其是早幼粒细胞白血病（APL），其在DIC发生率方面非常高，本次研究6例APL当中，TF-PCA增高占4例，且经临床诊断，均确诊为伴有DIC。近年研究指出^[7-8]，一些APL临床严重性出血，与纤溶活性增强造成原发性性纤溶亢进，以及AL细胞表面在annexinⅡ持续性增高相关。经本次研究得知，DIC与疑似DIC组的TF-PCA相比于其他各组，增高显著，而DIC组在TF-PCA方面相比于疑似DIC组，差异不明显，由此提示，TiFaCT检查，并与临床症状相结合，可为DIC诊断提供重要参考。通过对一些患者开展动态观察，得知TF-PCA的变化与其DIC治疗预后之间存在着紧密关联。

3.2TF-PCA方法的灵敏性与特异性

通过上述誓言得知，运用TFPI抑制缩短的TiFaCT实验，由此得知，实施移植之后，TiFaCT存在显著性延长，但对于全血当中的促凝活性而言，并无全部被抑制，由此得知，全血当中的PCA来源并非单一，仍有其他来源。运用流式细胞术实施测定得知，LPS刺激之后，全血当中的白细胞TF表达增高显著，至此，TiFaCT对TF-PCA的测定，在特异性方面比较高。另外，通过分析TF-PCA浓度反应曲线得知，此方法在灵敏性上也比较高，对6份LPS刺激标本开展1~24h的密切观察，得知于4h时，TF-PCA具有最强的表现，而到2h之后，仍有TF-PCA，由此可知，LPS刺激细胞TF-PAC，持续的时间比较长。

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