角膜胶原交联的研究进展

黄晓静，王婷

山东省眼科研究所，济南大学、山东省生命与医学科学院，山东济南 250021

通讯作者：王婷

摘要：随着角膜胶原交联术（CXL）的临床应用，它成为国际公认的唯一能有效控制圆锥角膜进展的治疗方法。它通过紫外光-核黄素发生的胶原交联反应提高角膜的机械强度，增强角膜生物力学稳定性。该治疗方法已被应用于多种角膜疾病的治疗，也取得了良好的临床效果。同时，各种操作的改进丰富了该治疗的适应症。本文就角膜交联治疗的对胶原交联治疗的原理、操作及改进、临床应用和前景进行综述。

关键词：角膜胶原交联；圆锥角膜；紫外线；核黄素

Abstract

With the clinical application of corneal cross-linking ,it has become an internationally recognized only can control the treatment of keratoconus progress. It happened by uv-riboflavin collagen crosslinking reaction increase mechanical strength of the cornea, corneal biomechanical stability. The treatment method has been applied in many kinds of corneal disease, also achieved good clinical effect. At the same time, various operating improvement enriched the indications for this treatment. In this paper, the corneal crosslinking treatment on collagen crosslinking treatment principle, operation and improvement, clinical application and prospect were reviewed.

Key words: corneal collagen cross-linking; Keratoconus; Ultraviolet; riboflavin

角膜组织是人体特殊的器官，位于眼球的前部，是接受外部光线的窗口及眼睛屈光系统的重要组成部分，还对眼球起到保护的作用，其重要的作用依赖于其透明性和结构的完整。胶原纤维是角膜各层组织中最重要的组成成分，胶原纤维的病理改变发生在很多的角膜病变中，比如圆锥角膜、角膜溃疡、感染性角膜病变等。自20世纪角膜胶原交联技术（corneal collagen cross-linking ,CXL）的开发应用，为角膜 疾病的治疗提供了新的途径。并取得了良好的临床效果。简要概括了角膜胶原交联治疗的原理、基本操作、临床应用及联合治疗方案。

1.角膜胶原交联治疗的原理

角膜是眼球的第一层屏障，是一种复杂的生物力学结构，组织学上从前到后依次为上皮细胞层，前弹力层，基质层，后弹力层和内皮细胞层。 角膜基质层占角膜厚度的90%，由大量的规则排列的胶原纤维和板层胶原内的基质细胞组成，是保持角膜生物力学稳定和抵抗外界力内皮量的主要结构。胶原纤维是维持角膜张力的决定因素。基质层和前弹力层是角膜主要的胶原纤维层，正常角膜中角膜基质内包含250-400层排列整齐规律的胶原纤维板层，每层胶原纤维直径相同、方向一致，层间有缝隙连接的角膜基质细胞，蛋白多糖在胶原纤维之间和纤维板之间充当粘合剂。[1]胶原纤维在不同层面的大小、方向不一致，由周边角膜缘环形纤维向中央区垂直和水平走向移行。胶原纤维的有序排列保持角膜的外观透明，瞳孔区角膜纤维排列更致密，来维持角膜强度和曲率，可以抵抗外力的拉伸作用。

角膜胶原交联技术是角膜基质中的核黄素吸收紫外光后被激活，通过赖氨酸氧化途径释放活性氧自由基，这些自由基诱导角膜胶原纤维间形成共价键，从而增加角膜的刚度的技术手段。最早交联技术应用于工业及生物工程。其原理是：蛋白质分子或其他分子之间在受热、辐射及压力下诱导发生的化学反应，改变了其理化性质[2]。紫外线可以使胶原蛋白糖基化，增强角膜基质强度，使蛋白变粗、变硬。1998年Seiler等发明了紫外线-核黄素角膜胶原交联技术应用于增加圆锥角膜患者角膜基质的硬度和强度，从而控制角膜扩张性疾病的发展[3]。Wollensak等2003年首次报道了紫外光-核黄素角膜胶原交联技术治疗圆锥角膜的临床应用，结果显示该方法可有效阻止圆锥角膜的进展，使患者保持较好的视觉质量，且治疗时间短、创伤小、避免或延迟了进行角膜移植等复杂手术方式[4]。

2.角膜胶原交联的基本效应

2．1生物力学强度

角膜中的光敏剂核黄素在吸收紫外线A后形成活性氧族，活性氧族诱导胶原纤维的氨基之间发生化学交联反应，角膜相邻胶原之间产生共价键，从而增强了角膜的生物力学稳定性。实验证实， 猪眼和人眼角膜进行角膜交联后，其机械强度分别增加了71.9%和328.9%[5]。

2.2提高组织对胶原酶的抗性

研究发现，进行了紫外光核黄素交联的角膜胶原纤维的空间构型改变了，因此对抗各种酶的作用的能力显著增强了。角膜组织中含有各种酶类，来维持角膜代谢的稳态。实验证实，经过胶原交联后的猪角膜可以在胶原酶溶液中存在15天，相对于没有交联的猪角膜显著延长[6]。

2.3抗水肿效应

胶原交联反应增加了胶原纤维之间的连接，因此有效阻断了水分向基质内渗透的过程。Wollensak等研究发现，进行了交联反应的猪角膜中，中央交联区域存在大量的无水肿膨胀的纤维，而在未交联的后部基质中，水肿较明显。因此该发现应用于大泡性角膜病变的治疗[7]。

2.4抗感染效应

核黄素具有光敏作用，光敏作用的抗微生物性能较强，紫外线对微生物的遗传物质亦有直接作用，同时氧化应激反应等联合作用下，交联反应在对抗感染性角膜疾病中有着积极的作用。

3.角膜胶原交联的基本操作及改进

3．1适应症 角膜胶原交联技术最先是应用于治疗圆锥交联的，因此交联的适应症是主要指圆锥角膜患者，其内容是：成年人（年龄大于18岁），角膜有进行性异常扩张，角膜厚度不低于400μm。在欧洲，相关的医师协会认为，角膜胶原交联同样可以应用于儿童和青少年患者，不需要考虑是否处于进展期。

3.2 经典的去上皮的角膜胶原交联

基本步骤：①机械法刮除直径7-9mm角膜上皮，②等渗0.1 %核黄素溶液溶于20%右旋糖酐T-500溶液中作为光敏剂，每1~3分钟点眼1次，持续点眼30min，保持角膜表面溶液均匀覆盖，裂隙灯显微镜钴蓝光观察前房有黄色闪辉。③使用波长（370±5）nm，照射量为3.0mW/cm²紫外线治疗仪，照射角膜30min，期间每2min点核黄素/右旋糖酐1次[8]。

3．3保留上皮的交联

由于去除上皮增加了术后疼痛、感染及发生并发症的风险，学者们提出了保留角膜上皮的做法[9]。吉拉兔进行跨上皮角膜交联（TE-CXL）研究显示，Yong氏模量的增加在去上皮组增加102.45%，促渗组增加21.3%，不加促渗剂组生物力学没有变化。结果表明，促渗剂组效果是去上皮组的1/5，促渗剂的核黄素-紫外光作用损伤发生在基质的前200um，利用该特点，跨上皮的快速胶原交联治疗可以防止因去上皮清创所造成的并发症，应用于小儿病例，亦有研究报道应用于角膜薄的患者。[10]

3.4高辐照快速率的CXL

美国的Shetty R等对138名患者实行传统的及加速的角膜交联治疗进行前瞻性研究，分为四组，分别用3mw/cm2用时３０分钟、９mw/cm2用时１０分钟,１８千瓦/cm2用时２５分钟，３０mw/cm2用时３分钟进行加速交联，对其最佳矫正远视力ＣＤＶＡ、等效球径SE，平的角膜曲率K1，最大角膜曲率K2等进行6个月及1年的研究，发现传统的方法、９mw/cm2用时１０分钟,１８千瓦/cm2均显示了更好的视觉、SE、曲率上的效果改变。第三组即18千瓦/cm2显示了最好的结果。K1的变化在传统组及第二组是最重要的。我国学者陈世豪等对加速的CXL安全性进行分析，对13只眼采用了能量为45mV/cm2紫外光，照射时间2min40s，分析术后7d、1个月、3个月、6个月的UCVA、BCVA、角膜曲率、角膜前后表面高度、角膜表面上下不对称指数、角膜最薄处厚度、角膜内皮细胞密度等，采用重复测量方差分析各参数变化，显示高辐照度快速经上皮角膜交联术是安全有效的方案[11]。

3．5低渗性核黄素的CXL

目前许多的学者正在研究各种方法技术来克服角膜厚度对CXL的局限性。Hafezi发现应用低渗性核黄素可以使角膜膨胀至原来的两倍厚度。该方法基于角膜基质蛋白聚糖的亲水性使基质膨胀。对于小于400um的圆锥角膜患者应用低渗性核黄素，使角膜厚度增加后再进行角膜胶原交联治疗，未见角膜内皮的明显损伤，为期一年的观察结果令人满意，但目前对于人为的膨胀角膜是否对角膜有所损伤不能确定，另外，水化的基质胶原蛋白浓度相对较低，可能会有小的生物力学影响。我国学者吴护平等应用低渗性核黄素治疗较薄型圆锥角膜患者，观察一年，术后角膜地形图有所改善，无角膜瘢痕发生，无内皮损伤。该方法安全有效，说明对于晚期角膜厚度＜400um患者这是一项可行性方案。但是也有专家提出，核黄素的浓度不当，可能不会有效的吸收所有的紫外线辐射，因此这仍是一项令人担忧的问题，仍需要进一步的随访观察和完善具体实施的详细步骤。

5.角膜胶原交联的临床应用

5.1圆锥角膜

角膜胶原交联自应用于临床10余年来，对交联的效果做了大量的研究。短期效果的研究发现：角膜最大曲率平均下降，裸眼远视力（UDBA）和最佳矫正视力（CDVA）均有不同程度的提高，术后无并发症的发生。角膜交联是延缓和阻止圆锥角膜进展的安全有效的方法，而且对视功能有一定程度的改善。

5.2屈光手术后角膜扩张

随着屈光手术的增多，术后角膜扩张的并发症的发生也有增加。交联治疗角膜扩张，有时因患者角膜对紫外线反应的差异出现不同的改变。因此，角膜扩张患者往往在病变晚期考虑交联治疗。Richoz 团队研究发现，角膜扩张患者Rmin明显增大，ISV,IVA,KI和CKI各项指标有明显降低，IHA,IHD没有明显变化。

5.3大泡性角膜病变

大泡性角膜病变是各种原因导致的角膜内皮功能失代偿，表现为角膜基质水肿，上皮或上皮下大泡形成。因胶原交联治疗可以增加胶原之间的连接，因此被应用于大泡性角膜病变的治疗。Ehlers等对11例不同原因引起的角膜水肿病人进行角膜交联治疗发现：10只眼角膜厚度变薄，基质水肿减轻，大部分患者视力好转。Arora等于2013年内对IOL植入术后的角膜水肿进行，角膜交联治疗患者视力明显提高，1个月平均角膜厚度有降低，随访3个月角膜厚度有所回弹，但仍低于治疗前[12]。

5.4感染性角膜溃疡

在多种感染性角膜疾病中病原菌会产生多种酶，对角膜基质中胶原纤维产生溶解作用，致角膜溶解。角膜交联后，角膜对抗酶的能力增强，同时核黄素经紫外线照射产生的氧自由基对病原微生物的核酸物质的直接破坏作用，使得对抗感染性角膜疾病发挥了较好的疗效。吴护平等对19只眼药物治疗无效的角膜病患者进行交联治疗，其中包括真菌感染15例、表皮葡萄球1例、铜绿假单胞菌1例，治疗后2个月，17只眼溃疡愈合，15只眼裸眼视力得到提高。

6.联合治疗方案

6.1角膜基质环植入联合角膜胶原交联

圆锥角膜患者进行交联治疗后，生物力学强度有提高，但是屈光水平仍无法满足需要，角膜基质环植入术是在角膜中央区植入基质环使得角膜屈光水平得到改善。Chan等将两者治疗方式结合，对21例患者进行角膜基质环植入术后，即对其中12例患者13只眼进行角膜胶原交联治疗，结构显示：联合手术的患者角膜曲率、柱镜度数、L-U比率的降低程度明显大于单纯手术患者。同时核黄素在基质环通道内的聚集，增强了周围交联的效应。对于圆锥角膜患者来说，联合手术是个有效的治疗方案。

6.2角膜交联联合屈光性表层切削术

角膜交联术对视力的提高是有限的，近年来尝试联合角膜屈光手术的研究，来更好的改善圆锥角膜患者的视力。Kymionis等通过PRK联合角膜交联术治疗早期圆锥角膜，跟踪25个月报道，患者视力、角膜曲率都有极大的改善。准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术（Epi-LASIK）手术作为一种新型角膜屈光手术，也被应用于联合手术，据报道，患者术后6个月内球、柱镜度数保持稳定，术后1、3、6个月的UCVA均较术前明显提高。术后BCVA无明显变化，术后平均角膜曲率较术前变小。虽然术后长期效果还待进一步追踪随访，但是其对视力的大幅度提高足以证明医学技术的先进性。

6.3角膜交联联合有晶体眼人工晶体植入术

CXL联合人工晶体植入术较适用于有比较好的远视力的进展期圆锥角膜，可以矫正中高度的屈光不正，患者不耐受隐形眼镜，有较强矫正散光期望的患者，但是不适合不规则散光患者。因缺少较大样本的临床数据，仍需要进一步深入研究。

7.结语

近10余年来，随着角膜胶原交联技术的成熟和发展，对于以圆锥角膜为代表的角膜扩张性 疾病，我们从束手无策到联合手术多方位提高患者的舒适度。这有赖于科技的突飞猛进的发展和临床医生对技术的不懈追求。去上皮的交联治疗仍然是最经典的可靠的治疗方案，一般应用于进展期的圆锥角膜，应严格控制适应症规范操作来避免并发症的发生。而近年来TE-CXL应用较多，并发症较少，适用于早期患者的干预，但毕竟其渗透程度和交联的效应差于去上皮法，因此适用于预防治疗。对于联合手术以及对各种疾病中的应用，仍需要进一步实验研究和临床观察。

参考文献

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2王明旭.不规则散光诊断与治疗[M].北京：科学出版社2009:

3王明旭.圆锥角膜与角膜膨隆—预防、诊断和处理 [M].北京：科学出版社，2012.5:2-20.

4Spoerl E,Huhle M,Seiler T.Induction of cross-links in corneal tissue Exp Eye Res 1998;66(1):97-103

5 Wollensak G,Spoerl E,Seiler T.Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus[J].Am J ophthalmol,2003,135(5):620-627.

6吴护平，罗顺荣，董诺，等。角膜胶原交联联合药物治疗感染性角膜疾病的临床研究[J].中华眼科杂志，2013,49（10）：890-895.

7Spoerl E,Wollensak G,Seiler T.Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion[J].Curr Eye Res ,2004,29(1):35-40.

8林志荣,吴护平,罗顺荣等.离子电渗介导的跨上皮角膜交联术治疗较薄型圆锥角膜的早期疗效观察[J].中华眼科杂志,2015,51(9):677-682.

9De Bernardo M,Capasso L,Tortori A,et al.Trans epithelial corneal collagen crosslinking for progressive keratoconus:6 months follow up[J].Cont Lens Antrior Eye,2014,37(6):438-441.

10吴护平,罗顺荣,董诺等.低渗性核黄素在角膜胶原交联治疗较薄型圆锥角膜中的临床研究[J].中华眼科杂志,2014,50(9):681-686.

11Fillippello M,Stagni E,O’Brart D.Transepithelial corneal collagen crosslinking:Bilateral study.[J].Cataract Refract Surg ;2012,38(2):283-291.