低分子量透明质酸经由MyD88/TLR4非依赖性通路抑制LPS诱导的急性肺损伤炎症信号因子表达

王灿灿冯月娟徐长青童岳阳杜玲儿郁东伟

杭州师范大学附属医院浙江省杭州市邮编：310015

基金项目：①2012年杭州市医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项(编号：20110833B32);②2012年浙江省中医药管理局(编号：2012ZA105);③2012年杭州市科技发展计划项目(编号：20130633B12);④2014年浙江省卫生厅医药卫生一般项目(编号：2014KYB196);⑤2014年浙江省医药卫生科技项目(编号：201466009)．

作者简介：王灿灿，女（1983年），宁海人，住院医师，硕士学位，呼吸病学方向。

[关键词]低分子量透明质酸；MyD88；TLR4；TRIF；PI3K/Akt

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0119-02

[摘要]目的：探讨低分子量透明质酸在LPS诱导的急性肺损伤炎症信号因子中的调控作用。方法：采用LPS与低分子量透明质酸对野生型与TLR4?/?小鼠干预，通过免疫组化，ELISA，westernbolt对各因子表达进行分析。结果。COX-2，IL-6，IL-8，TNF-α炎症因子以及MyD88,TRIF在低分子量透明质酸与LPS干预下表达量升高（p<0.05），但TLR4?/?小鼠要低于野生型小鼠(p<0.05)。低分子量透明质酸干预8小时，MyD88,TRIF表达量下降(p<0.05)。结论:低分子量透明质酸干预可激活LPS介导的PI3K/Akt通路引起细胞炎症因子的上调表达，并抑制MyD88与TRIF表达来下调炎症因子表达。

LowmolecularmasshyaluronanreduceLPSmediatedInflammatorysignaling

inAcutelunginjuryviaMyD88/TLR4independentpathway

WangCancan，FengYuejuan，Xuchangqing，TongYueyang，DuLinger，YuDongwei

(AffiliatedHospitalofHangzhouNormalUniversity,HANGZHOU,310015,China；)

[KEYWORDS]Lowmolecularmasshyaluronan,MyD88,TRIF,TLR4,PI3K/Akt

[ABSTRACT]AIM:ToinvestigatethemechanismunderlyingtheattenuationofLPS-inducedlunginflammationbylowmolecularmasshyaluronan.METHODS:AnalyzetheexpressionlevelsoftheinflammatoryfactorinducedbyLPSinbothwildtypeandTLR4?/?mice.RESULTS:COX-2，IL-6，IL-8，TNF-αandMyD88,TRIFinducedbyLPSandlowmolecularmasshyaluronanwereupregulated(p<0.05),ButthefactorsinTLR4?/?micewerelowerthanthewildtype(p<0.05).TheexpressionofMyD88,TRIFreducedat8hourswhentreatedwithLowmolecularmasshyaluronan.CONCLUSION:thePI3K/AktpathwaywasactivatedandtheinhibitionofMyD88andTRIFwereinvolvedintheprotectiveeffectsofLMMonLPS-inducedacuteinflammatoryresponses.

急性肺损伤（Acutelunginjury，ALI）是急性呼吸窘迫综合征（Acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）的前期阶段，每年都会有较多ALI/ARDS患者，并且约有40-70%的高死亡率[1]。如何防止ALI/ARDS也是该领域研究的一个热点。急性肺损伤的发生有很多因素，但是目前普遍认为炎症反应是其本质原因，自身炎症/抗炎系统紊乱，导致病情恶化。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌外膜的一种糖蛋白，能直接或间接损伤肺微细管内皮细胞，引起肺水肿，触发急性肺损伤[3]。现在普遍研究认为LPS是通过细胞表面TRL4受体，通过MyD88依赖与非依赖的方式引发胞内一系列炎症反应，近年发现也存在TRL4非依赖型通路。有研究显示，透明质酸包括高分子量与低分子量（HMM,LMM）且具有不同的生理作用，低分子量透明质酸（Lowmolecularmasshyaluronan，LMMHA）较多学者认为具有促炎作用，但也有研究显示一定程度上保护呼吸道粘膜[4]，另外也有报道称0.2%的低分子量透明质酸对炎症有一定的抑制效果[5]，我们以前的研究也发现低分子量透明质酸能抑制巨噬细胞TNF-α，IL-6等炎症因子。因此，本研究主要在MyD88/TLR4非依赖性通路探讨LMM透明质酸能否降低LPS诱导的急性肺损伤的炎症因子表达。

1材料与方法

实验动物

C57BL/6小鼠（雄性，8-10周，20-24g）由复旦大学医学院动物中心（上海）提供。TLR4?/?小鼠购自美国Jackson实验室（美国），所有小鼠均供以灭菌水与辐照杀菌后的饲料并单独喂养（复旦大学医学院）。LPS20ug溶于50ul生理盐水对每只小鼠给药，LMM透明质酸（200kDa,65mg/kg），采用微型喷雾器（Penn-Century,Wyndmmoor，PA）对小鼠直接静脉注射。

1.2研究方法

1.2.1免疫组化实验方法：

将小鼠待测肺部组织进行冰冻切片，40g/L多聚甲醛固定，依次经3ml/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，100g/L山羊血清封闭，滴加兔抗鼠MyD88（血肿周围组织，1:5000，Abcam公司，UK）和兔抗鼠TLR4(小神经胶质细胞，1：500，Abcam公司，UK)，4°C过夜，滴加HPR标记二抗，DAB显色苏木素复染细胞核。

1.2.2实时定量PCR

采用立体显微镜，对给药后的小鼠分别以血凝块为核心，收集体积为4×4×4mm3大小的血肿周围组织切块，并用Trizol试剂(Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)收集该组织总RNA。采用iScriptcDNASynthesis试剂盒（Bio-Rad）对得到的总RNA进行反转录为cDNA.实时定量PCR采用IQTMSYBER?GreenSupermix(Bio-Rad)，TLR4引物为分别为5’-GTCAGTGTGATTGTGGTATCC-3’，5’-ACCCAGTCC-TCATTCTGACTC-3’。并采用ΔCT方法计算表达量。

1.2.3酶联免疫（ELISA）

分别收集实验小鼠血肿周围组织切块80mg，并在12000g离心后保留上清液待测，采用ELISA试剂盒（达科为生物，深圳）检测其COX-2，IL-6，IL-8，TNF-α以及MyD88和TRIF表达水平。

1.2.4Westernblot分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对80mg血肿周围组织或（1×105）小神经胶质细胞进行蛋白分离，并转移到PVDF（AmershamPharmacia）膜上。对PVDF膜进行孵育一抗，包括：兔抗鼠MyD88（血肿周围组织，1:5000，Abcam公司，UK）和兔抗鼠TLR4(小神经胶质细胞，1：500，Abcam公司，UK)，之后孵育过氧化物酶标记二抗（1:2000，晶美生物，江苏）,结果用ECL显色系统显色（AmershamPharmacia）。PVDF膜用strippingbuffer清洗后孵育β-actin（傲雅生物，重庆）标记抗体并显色作为对照。采用扫描显像系统以及自带成像系统对结果进行定量分析。

统计学分析

本次研究采用统计软件SPSS11.5(Chicago,IL,USA)对数据进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示，经t检验。以P<0.05判定差异有统计学意义。

2结果

2.1TLR4，MyD88以及TRIF蛋白在LPS干预后表达水平分析

实时定量PCR结果显示，在LPS干预的急性肺损伤小鼠肺组织中，TLR-4mRNA表达水平与DMSO相比随时间延长而升高（图4.A）。免疫组化实验对比野生型与TLR4?/?小鼠，实验小鼠在LPS与LMM透明质酸干预后，TLR4?/?小鼠MyD88和TRIF表达水平要低于野生型小鼠（图4.B,C,D）。

实时定量PCR方法显示小鼠急性肺损伤TLR-4mRNA在LPS干预1,2,4和8小时后表达水平，LPS(20ug/只)，（n=6）。

野生型与TLR4?/?小鼠组织苏木精伊红染色（200倍放大显示）。

肺部组织LPS与LMM干预后8小时后MyD88与TRIF表达水平免疫组化结果。

野生型与TLR4?/?小鼠急性肺损伤MyD88与TRIF表达水平。通过MoticMed6.0digitalmedicalimage分析积分吸光度（Integralopticaldensity,IOD）检测小鼠肺组织MyD88和TRIF阳性细胞。mean±SEM（n=3）*P<0.05,**P<0.01.

2.2LMM透明质酸干预后促炎因子释放水平

ELISA结果显示，在LPS与LMM透明质酸干预后，COX-2,IL-6,TNF-a以及IL-8炎症因子释放水平随时间延长而升高，TLR4?/?小鼠COX-2,IL-6,TNF-a以及IL-8表达水平均低于野生型小鼠，具有统计学意义（p<0.05），（见图2.A,B,C,D，n=6）。LMM透明质酸干预后，比较两组小鼠肺组织上清液中MyD88与TRIF表达水平，TLR4?/?表达量明显低于野生型小鼠，且具有显著性差异（p<0.05）(见图2.E,F)。

A,B,C,D,ELISA方法显示，LMM透明质酸引起LPS诱导的野生型与TLR4?/?小鼠COX-2,IL-6,TNF-a以及IL-8释放水平检测

E,F野生型与TLR4?/?小鼠LMM处理后肺组织上清液ELISA检测MyD88和TRIF表达水平

2.3LMM抑制LPS诱导MyD88和TRIF表达

取小鼠肺部组织进行westernblot分析，无论野生型还是TLR4?/?小鼠，在LPS+LMM干预后，MyD88和TRIF胞内表达水平均增加（2,4小时），但在干预8小时，两组小鼠的MyD88和TRIF急剧下降，且具有显著性差异（p<0.05）（见图3）。

A,免疫印迹实验结果显示野生型与TLR4?/?小鼠在LPS与LMM处理1,2,4,以及8小时后，肺组织MyD88和TRIF蛋白表达水平

B，野生型与TLR4?/?小鼠LPS与LMM处理1,2,4,以及8小时后MyD88和TRIF蛋白表达水平定量分析（扫描成像系统，means±SEM。n=4。*P<0.05,**P<0.01。），

3结论

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的一种组成成分，由类脂A，o-特异侧链，内核心以及外核心组成。在细菌大量繁殖和死亡时，释放到胞外，在生物体内引发炎症反应[6]。Toll样受体（Toll-likereceptor,TLRs）是一种先天性免疫模式识别受体，通过识别病原因子来迅速激活自身天然免疫系统，在1997[7]年被首次发现，之后十几种Toll受体被陆续发现。TLRs是一类跨膜蛋白，胞外区富含亮氨酸参与识别各类抗原，其中TLR4主要识别革兰氏阴性菌细胞壁LPS。TLR4信号通路可以通过包括抗原介导的MyD88依赖性[8]以及MyD88非依赖型[9]（TRIF依赖型）两条通路激活下游信号，引起炎症因子的上调表达。前者主要是LPS与TLR4/(髓样分化蛋白-2)MD-2受体结合，调节TLR4识别LPS,TLR4二聚化启动信号转导，通过募集MyD88，然后MyD88与IL-1受体相关激酶蛋白分子结合为复合物，使IRAK发生磷酸化并与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）结合，活化TRAF6,之后与转化生长因子β激活激酶1（TAK-1）发生作用后活化TAK-1，磷酸化NF-βB诱导激酶使NIK磷酸化，之后激活NF-ΚB导致一系列炎症因子上调表达。TRIF（TIR-domain-containingadapter-inducinginterferon-β）依赖型途径则是通过LPS结合TLR4后，通过TRIF而不经由MyD88引起信号转导，最后激活NF-ΚB。LPS刺激引起炎症反应主要是依靠这两条通路，但也有研究发现LPS能够通过其他通路如PI3K/Akt通路激活NF-ΚB[10，11]。本研究中，在小鼠肺组织经LPS刺激后，TLR4mRNA表达明显升高（图1.A），此结果表明LPS刺激可经由TLR4通路。另外在使用TLR4?/?小鼠经LPS与LMM透明质酸刺激后，经免疫组化，ELISA，western-blot实验，结果表明LPS依然能引起MyD88与TRIF的高表达（图1；图2.E-F；图3）。另外在TLR4敲除的情况下，依然能导致COX-2，IL-6，IL-8，TNF-α炎症因子的高表达（图2.A,B,C,D）。此结果表明LPS可以不通过TLR4/MyD88而激活PI3K/Akt通路引起细胞炎症因子的上调表达。

透明质酸包括高分子量透明质酸（HMMHA）与低分子量透明质酸（LMMHA）,而二者的生理作用却极为不同，较多学者认为HMM透明质酸可以抗炎作用[12]，LMM透明质酸存在促炎作用[13]，我们以前研究显示LMM作用于LPS干预的小鼠与RAW264.7巨噬细胞，可以抑制TNF-α与IL-6的表达。在本研究中，在LMM透明质酸与LPS共同作用于实验小鼠，在干预8h时，无论野生型还是TLR4?/?小鼠，其MyD88与TRIF表达量均有所下降（图3），另外免疫组化，ELISA实验结果显示，LMM透明质酸干预后TLR4?/?小鼠MyD88与TRIF表达水平明显少于野生型小鼠（图1,2），而比较COX-2，IL-6，IL-8，TNF-α炎症因子的表达水平，TLR4?/?小鼠要低于野生型小鼠（图2）。

综上所述LMM透明质酸干预或可激活LPS介导的PI3K/Akt通路引起细胞炎症因子的上调表达，并抑制MyD88与TRIF表达来下调炎症因子表达。

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