微生物群落结构的分析方法

邓斌1朱国飞1许存宾1杨琴通讯作者

作者单位：1.贵州理工学院制药工程学院，贵州贵阳550003

2.贵州理工学院轻工工程学院，贵州贵阳550003

DOI：10.7504/nk2016010203中图分类号：746.3文献标识码：A

摘要：目的：微生物群落和癌症等许多疾病的发生发展相关。一些新的技术如分子生物学技术为微生物群落结构的研究提供了有力的工具。这篇文章将对微生物群落结构的研究方法进行综述。

关键词：微生物群落；多样性；16SrRNA基因

MethodsforAnalyzingMicrobialCommunityStructure

DENGBin1,ZHUGuo-fei1,XUCun-bin1,YANGQin2

1.SchoolofPharmaceuticalEngineering,GuizhouInstituteofTechnology,Guiyang550003,China.

2.SchooloflightEngineering,GuizhouInstituteofTechnology,Guiyang550003,China.

[ABSTRACT]Microbialcommunitiesplayanimportantroleinthedevelopmentofdiseasessuchascancer.Noveltechniquesespeciallymoleculartechniqueshaveprovidedtoolsforanalyzingmicrobialcommunities.Inthispaper,wewillreviewsomemethodsforstudyingmicrobialcommunitystructure.

[KEYWORDS]Microbialcommunity;persity;16SrRNAgene

1前言

微生物群落在生态、农业、健康等方面发挥着非常重要的作用，比如直接导致癌症的发生和发展[1]。同时，微生物还能作为治疗癌症的一个重要手段[2]。对人体微生物群落的研究将在癌症的防治中发挥越来越重要的作用。而研究微生物群落结构主要是对其多样性（包括表型多样性和基因型多样性）进行分析。表1列举了研究微生物多样性的常用方法。下面我们将对其中最常用的几个技术进行综述。

表1微生物多样性分析的方法

2克隆文库分析

克隆文库方法是基于DNA提取，16SrRNA基因扩增和序列测定（图1）。16SrRNA基因可以作为多样性研究的一个标记分子，因为它是所有微生物细胞的重要组成部分，具有高度保守的引物结合位点和高度易变的可供特定微生物鉴定的特异性位点[18]。很少有证据表明16SrRNA基因在物种间进行水平转移。克隆文库方法有很多优点，比如：简单易行；通用引物的使用可以让我们不用对微生物物种的背景知识进行了解；微生物群落能够进行聚类分析。但是也有一些缺点，比如：测序较为昂贵；在DNA提取和PCR扩增的过程中会出现偏差；克隆数量非常有限，分析深度不够。

图1克隆文库分析的流程

3DGGE

DGGE是一种分析片段长度相同但核苷酸序列不同的DNA片段的方法（图2）。在实际操作过程中，首先通过PCR反应扩增出片段。然后利用G-C碱基配对的稳定性高于A-T配对的特点。不同序列的DNA片段混合物在含有等梯度浓度DNA变性剂的丙烯酰胺凝胶电泳中得以分离。在一般情况下，GC含量更高的DNA片段将更加稳定并保持双链状态，直到遇到更高浓度的变性剂才解链。双链DNA在丙烯酰胺凝胶中迁移得更快，而变性的DNA分子在凝胶中则更慢。按照这种方式，不同的序列的DNA片段可以在聚丙烯酰胺凝胶中被分离[19]。

DGGE的优点非常多，比如：对DNA序列的差异性非常敏感；允许同时分析多个样品；能够实时监测微生物群落结构的变化；DGGE还可应用于功能基因的分析。DGGE的缺点主要包括：非常耗时；在DNA提取和PCR扩增的过程中会出现偏差；在不同微生物的16SrRNA基因拷贝数的变化使这种技术只能进行“半定量”分析；异源双链的存在也可使结果出现偏差；不能进行全自动分析。

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图2DGGE分析的流程

4第二代测序技术

第二代测序技术是DNA测序技术的一次革命。它的发展迅速变化地改变了遗传学的发展史。它的出现是以Roche454、Illuminasolexa、ABISOLiD等几个测序仪器的使用为标志。他们的测序原理分别是基于焦磷酸测序、聚合酶、连接法。与传统的Sanger法测序相比，对单位长度DNA进行测序的成本下降了几个数量级[16]。对数百个样品的16SrRNA基因高变区进行高通量的测序（图3）可更精确地描述微生物群落结构[20]。

第二代测序技术有很多优点，比如：第二代测序技术可以快速廉价地进行微生物群落的分析；可以得到相对准确的结果；每次可以分析数百个样品；基本能够实现定量。同时也有一些不足，比如：具有所有基于PCR的分析技术一样的缺点，那就是DNA提取和PCR扩增的偏差；每次运行的成本太高；只能对短片段（<400bp）进行测序，限制了其对多样性的测定。

图3第二代测序技术用于微生物群落分析的流程

5结论

根据上述所述的各种方法的分析，我们得出以下结论：（1）没有一种方法会绝对地对微生物群落结构进行定量分析，每一种方法都存在偏差。（2）基于第二代测序技术的方法将逐渐取代DGGE和其他常用的分子生物学方法[20]。（3）将两种或两种以上的方法进行有机的结合会让我们更全面地地了解微生物群落的多样性。

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