高压氧促进了绿色荧光蛋白标记神经干细胞在局灶性脑缺血大鼠脑组织中迁移

李伟伟王子申衣启君赵国光史会建李伟彦

[摘要]目的探讨高压氧（HBO）对绿色荧光蛋白（GFP）标记神经干细胞（NSCs）在局灶性脑缺血大鼠脑组织迁移的影响。方法清洁级雄性SD大鼠39只，体重250-300g,随机分为3组(n=13):神经干细胞移植组（NSCs组）,高压氧+神经干细胞移植组（HBO+NSCs组）与常压氧+神经干细胞组（Cyy+NSCs组）。各组按改进的Longa法制作大脑中动脉阻塞模型，各组均缺血1.5h后再灌注。再灌注24h后，各组经侧脑室注射GFP标记的NSCs悬液（浓度1×106／μl）。侧脑室注射后2h，HBO+NSCs组开始每天1h的高压氧（HBO）治疗;Cyy+NSCs则常压下吸95%的氧气;NSCs组仅吸空气，各组治疗连续7天。第9天，处死大鼠。收集海马标本，检测各组大鼠海马caspase-3及脑源性神经营养因子（BDNF）与血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达量，并行脑组织冰冻切片，荧光显微镜下观察细胞的迁移情况。结果与NSCs相比HBO+NSCs组与Cyy+NSCs组海马caspase-3含量减少（P＜0.05），但与Cyy+NSCs组相比，HBO+NSCs组海马caspase-3含量明显较低（P＜0.05）。与NSCs相比HBO+NSCs组与Cyy+NSCs组海马BDNF与VEGF的表达量升高，但与HBO+NSCs组相比Cyy+NSCs组海马BDNF与VEGF的表达量明显减低（P＜0.05）。与NSCs相比，HBO+NSCs组与Cyy+NSCs组缺血区GFP-阳性细胞数升高;但与HBO+NSCs组相比，Cyy+NSCs组缺血区GFP-阳性细胞数明显不及（P＜0.05）。结论HBO可以更好的促进GFP-标记的NSCs在MCAO模型大鼠脑组织内的迁移，其促迁移机制可能与HBO可以促进BDNF与VEGF的分泌，抑制新生细胞的凋亡有关。

[关键词]高压氧神经干细胞移植绿色荧光蛋白脑缺血caspase-3脑源性神经营养因子血管内皮生长因子

DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.48.27

作者单位：李伟伟，王子申，衣启君，赵国光，史会建，271000，山东省泰安市，泰山医学院附属医院；李伟彦，210002，江苏省南京市，南京军区总医院麻醉科。

通讯作者：王子申，泰山医学院附属医院副主任医师。

Hyperbaricoxyenpromotedthemigrationofgreenfluorescentproteinlabelingneuralstemcellsinratssufferingfocalcerebralischemia

LIWeiweiWANGZishenYIQijunZHAOGuoguangSHIHuijianLIWeiyan

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofhyperbaricoxyenonthemigrationofgreenfluorescentprotein(GFP)labelingneuralstemcellsinratssufferingfocalcerebralischemia.MethodThirty-ninemaleSDratsweighed250-300gwererandomlypidedinto3groups(n=13pergroup):theneuralstemcellstransplantationgroup(NSCsgroup),hyperbaricoxyen+neuralstemcellstransplantationgroup(HBO+NSCsgroup)andatmosphericoxygen+neuralstemcelltransplantationgroup(Cyy+NSCsgroup).Firstly,themodifiedMACOmodelwasmadeinallrats,allgroupsrestoredsupply1.5hafterocclusion.Twentyfourhoursafterreperfusion,5μlsuspensionsofNSCs(densityas1×106／μl,derivedfromnew24h-bornrats’hippocampus)wereinjectedintoventricleofratsinallgroups.TwohoursafterintracerebroventricularinjectiontheratsintheHBO+NSCsgroupstarted1h’shyperbaricoxygentreatmentperdayfor7days.TheCyy+NSCsgroupwasexposedto95%oxygenundernormalatmosphericpressurefor7days,whileratsinNSCsgroupsjustinhaledairfor7days.Atthe9thday,allratswerekilledimmediately,Thehippocampuswasharvestedforcaspase-3andtheexpressionofbrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)andvascularendothelialgrowthfactor(VEGF).Atthesametimethebraintissuesectionsweremadeandthemigrationofgreenfluorescentprotein(GFP)labelingneuralstemcellswasobservedunderthefluorescencemicroscope.ResultsComparedwithNSCsgroup,thelevelofcaspase-3inhippocampusweresignificantlydecreasedinthegroupCyy+NSCsandHBO+NSCsgroup(P＜0.05).ComparedwithHBO+NSCsgroup,theseindexesofgroupCyy+NSCsweremarkedlyhigher(P＜0.05).ComparedwithNSCsgroup,theexpressionofBDNFandVEGFinhippocampusandthenumberofGFP-positivecellsintheischemicareaweresignificantlyincreasedinthegroupCyy+NSCsandHBO+NSCsgroup(P＜0.05).ComparedwithHBO+NSCsgroup,theseindexesofgroupCyy+NSCsweremarkedlylower(P＜0.05).ConclusionHyperbaricoxygencanimprovethemigrationofgreenfluorescentprotein(GFP)labelingneuralstemcellsinbraintissuressufferingfocalcerebralischemiawhichmightresultfromthebettereffectonthelevelsofcaspase-3andBDNFandVEGFinhippocampus.

Keywords：hyperbaricoxygen；neuralstemcellstransplantation；greenfluorescentprotein；cerebralischemia；caspase-3；BDNF；VEGF

前言

缺血缺氧性脑病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，致死率与致残率均较高，存活者大多留有不同程度的神经功能缺损，挽救缺血半暗带濒死的神经元和促进损伤后神经功能的恢复是治疗的关键。如何应用各种措施更好使病人神经功能得到改善一直是各方学者研究的重点。外源性神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）移植用于脑缺血模型中，并在脑组织中迁移分化国内外均有报道，并且多项研究表明绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)可以作为外源性神经干细胞在体内迁移分化的良好示踪。高压氧（hyperbaricoxygen,HBO）用于治疗缺血缺氧性脑病的疗效已经得到证实，本文重在研究HBO对外源性GFP-标记NSCs在局灶性脑缺血大鼠脑组织迁移的影响。

材料与方法

动物与分组39只雄性SD大鼠，清洁级，体重250-300g，自由饮食水，保持12小时日夜交替，随机分为3组，（n=13）：神经干细胞移植组（NSCs组）,神经干细胞+高压氧组（HBO+NSCs组）与神经干细胞+常压氧组（Cyy+NSCs组）各组处理方案见下文。

MACO模型各组大鼠腹腔注射2％戊巴比妥50mg／Kg麻醉,参照Longa法略加改进制作脑缺血模型，即分离、结扎并切断右侧颈外动脉，由颈总和颈内动脉缓慢插入直径为(0.36±0.02)mm的单尼龙栓线，进线深度距颈动脉分叉处(1.8±0.1)cm阻塞大脑中动脉入口造成缺血。再灌注24小时后，按Longa的5分法进行神经功能评分即0分：无神经缺损症状，1分：左前肢不能完全伸直，2分：向左旋转，3分：向左倾倒，4分：不能自己行走或昏迷。1~3分为有效模型。

神经干细胞复苏GFP-标记的SD大鼠NSCs（购于赛业广东技术有限公司）,取出细胞迅速放入370C水域中快速晃动直至冻存液完全溶解,吸出细胞悬液并加入10倍DMEM/F12（1:1）的无血清培养基（内含bFGF20μg/L,EGF20μg/L,B2720ml/L,L-谷氨酰胺2mmol/L,青霉素和链霉素1×105U/L）离心弃上清，重悬细胞于完全培养基，置37℃、5%CO2孵育箱中培养。5-7天传代一次，细胞传至第三代神经细胞球形成时，行神经上皮干细胞蛋白（NeuoepithelialStemCellProtein,Nestin)免疫荧光染色，NSCs纯度达到90%可以进行下一步实验。

NSCs脑室注射再灌注后24小时，NSCs组、HBO+NSCs组与Cyy+NSCs组大鼠,2％戊巴比妥麻醉后，在立体定向仪的固定下，通过微量注射器将上述制备的NSCs悬液5μl（密度为106/μl）注入右侧侧脑室，注射位点坐标：AP=-0.8mm，MR=-1.5mm,DV=-3.5mm。

高压氧治疗侧脑室注射后2小时，HBO+NSCs组立即给予高压氧治疗,先用纯氧洗仓10min，使舱内氧浓度>95%再0.0125MPa／min的速率加压至0.2MPa，在高压下停留60min，其间用纯氧通风10分钟，停毕匀速减至常压，连续7日。Cyy+NSCs组常压吸95%的氧气，连续7日，NSCs组仅吸空气。

海马标本各组大鼠于侧脑室注射后第8日，腹腔注射戊巴比妥50mg∕Kg后处死各组大鼠，取海马存于液氮。

海马caspase-3采用westernblot法进行测定，取各组海马，胰酶消化后加入裂解液缓冲液中充分裂解，40C13000×g离心，取上清，获得蛋白样本。将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为100ug，并于95-100℃5min后冰上冷却上样。电泳条件：浓缩胶恒压60V约20min，分离胶80V约80min。取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15min。准备滤纸及NC膜，分别置入转移缓冲液及去离子水中。平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200mA通电，电转移1h。平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200mA通电，电转移1h。按约0.1ml/cm2的量加入封闭液和适量一抗（1：500稀释，Jackson公司）。摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。PBST漂洗滤膜4次，每次10min。将膜与HRP结合的二抗（辣根过氧化酶标记羊抗兔,Jackson公司二抗用封闭液稀释）(1:5000)室温下摇荡孵育2h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10min。按0.1ml/cm2显影液计算用量，将显影液加于NC膜上，室温放置1min。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带。采用imageJ分析软件分析，以目标条带与β-action灰度比值反应caspase3的表达水平。

Real-timePCR检测各组大鼠分别取3只戊巴比妥麻醉，0.9﹪氯化钠灌注后取右侧海马，采用RT-PCR法测定脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）与血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）mRNA的表达。用总RNA抽提试剂盒（Invitrogenlifetechnologies,美国）分别提取海马BDNF与VEGF，使用分光光度计对RNA的质和量鉴定。用MMLV反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行聚合酶链反应扩增，引物用Primer5.0软件设计，BDNF上游引物5-TTCCCCAGCGGTCTTCCCGC-3,下游引物5-CAGGCGGTTGTTCAGGTACA-3；VEGF上游引物5-GAGTTAAACGAACGTACTTGCAGA-3，下游引物5-TCTAGTTCCCGAAACCCTGA-3；β-Actin上游引物5’-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3’，下游引物5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’。反应条件：95℃，5min；40个PCR循环。电泳图证实PCR扩增的特异性，实验结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法。

冰冻切片侧脑室注射后第8天，各组大鼠分别取6只，2％戊巴比妥麻醉后，处死取新鲜脑组织，OTC（聚乙二醇和聚乙烯醇水溶物）包埋后，行脑组织冰冻切片，每隔100μm切取5张，片厚25μm。组织切片经PBS水化后，行DAPI(一种能与DNA结合的强力染料，紫外光激发下发蓝光)染色10分钟。荧光显微镜下观察细胞的迁移情况，并拍照。

统计分析采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据比较采用单因素方差分析。

实验结果

各组大鼠westernblot检测海马caspase-3灰度比值结果中，HBO+NSCs组caspase-3的表达量明显低于NSCs组和Cyy+NSCs组（P<0.05）；同时Cyy+NSCs组与NSCs组比较caspase-3的表达量也成下降趋势（P<0.05）。见图1。Realtime-PCR检测海马BDNF与VEGF含量结果中，HBO+NSCs组中海马BDNF与VEGF的mRNA表达明显高于NSCs组和Cyy+NSCs组（P<0.05）；同时Cyy+NSCs组两者mRNA表达量也高于NSCs组（P<0.05），见表1。荧光显微镜下观察脑组织冰冻切片，发现GFP-标记NSCs移植后7天，移植细胞迁移至海马与缺血损伤区，但细胞存活量相对移植量明显减少，大多数细胞仍然局限于针道附近仅少数细胞迁移至缺血损伤区，移植后7天绿色荧光的表达仍然很强,见图2，3，4。HBO+NSCs组缺血损伤区移植细胞数量明显高于Cyy+NSCs组与NSCs组，差异具有统计学意义（P<0.05），Cyy+NSCs组缺血损伤区移植细胞的存活量也高于NSCs组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表5镜下未见瘤体的形成与胶质瘢痕的发生。

讨论

缺血性脑部疾患的发生率一直居高不下，在美国每年超过有700000病人因中风导致偏瘫，是第三大致死性疾病之一。在我国脑血管病致残率、致死率也相当高,存活者大多留有不同程度的神经功能缺损，如何更好的使病人的神经功能得到改善一直是各方学者研究的重点，神经干细胞的发现为缺血缺氧性脑病的治疗提供了新的途径。

1992年Reynolds等从成年小鼠纹状体中分离出在体外不断分裂增殖，并具有多向分化潜能的细胞，NSCs的概念被首次提出[1]。NSCs是具有自我更新和分化潜能的细胞，在中枢神经系统(CNS)中它可以分化为三种主要的细胞类型，神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞[2]。NSCs可以对缺血损伤产生应答，并迁移至缺血损伤区，替代损伤脑组织或分泌神经生长因子，促进血管与神经生成[3]。已有报道显示局灶性脑缺血模型移植的神经干细胞可以生存，分化，释放神经递质并建立传入与传出联系与宿主脑组织，修复缺血引起的功能缺损[4,5]。但许多研究又同时证实NSCs移植后，只有极少数的细胞存活，分化为神经元的比例又少之又少。ModoM在其研究中发现，大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）造成的缺血模型中不到0.01％损伤神经元被移植的NSCs所替代[6]。因此如何应用措施更好的提高移植NSCs的成活率，促进其迁移至缺血损伤区并分化为神经元，是当前急待解决的难题。

HBO用于治疗脑缺血再灌注已有报道，许多研究证实HBO对脑缺血再灌注的保护作用机制十分广泛，涉及多个环节，包括提高氧分压增加血液和组织氧含量，提高氧的弥散率和有效弥散距离，促进神经细胞功能的恢复，改善脑水肿，降低颅内压，促进侧支循环的建立及病变血管的恢复，改善脑代谢，恢复脑功能等作用[7,8,9]，以往作者的研究认为缺血缺氧性脑损伤后HBO可以促进内源性神经干细胞的增殖并分化为神经元[10,11],但对外源性NSCs在缺血缺氧性脑病的影响国内很少研究。GFP是一种生物发光蛋白，在蓝光激发下可稳定发出绿色荧光，研究显示GFP基因在NSCs中的整合和表达对NSCs的基本生物学特征如形态，增殖能力和分化潜能没有明显影响。并且在移植后的大鼠脑内绿色荧光的强表达持续较长时间[12]，因此GFP对NSCs移植后观察体内分化迁移等方面有独到之处。本实验主要观察HBO对GFP重组腺病毒载体感染的NSCs在局灶性脑缺血大鼠脑组织中的迁移情况。

移植后NSCs成活率大部分取决于移植时间点宿主所处的微环境[13]。已有报道提到脑损伤后会产生局部炎性应答，严重影响移植细胞的生存与分化。脑缺血后宿主的免疫系统被激活，单核细胞与嗜中性粒细胞迁移到缺血周边区，释放炎性因子[14]。HBO可以有效增加氧的弥散距离，增加组织储氧量，同时增加缺氧脑组织的SOD(超氧化物歧化酶)，提高抗氧化能力清除过多的氧自由基[15]。这有效改善了缺血损伤区脑组织的局部微环境，减少炎性因子的产生，有利于移植细胞的生存与迁移。本实验中HBO+NSCs组与NSCs组，Cyy+NSCs组比较生存并迁移到缺血损伤区的细胞明显增多，这表明HBO可以促进移植后的NSCs的迁移。

为了更好的理解HBO促NSCs迁移的机制我们分析了海马caspase-3含量与BDNF与VEGFmRNA的表达量。caspase-3不仅促进脑发育时期神经元的凋亡，而且还可促进各种因素引起的神经元的凋亡，脑缺血后HBO+NSCs组与NSCs组，Cyy+NSCs组是caspase级联反应下游最关键的执行蛋白，在各种因素本启动的凋亡程序中起着最后枢纽的作用。NSCs可以分泌多种细胞因子，其中就包括脑源性神经生长因子（BDNF）,血管内皮生长因子（VEGF）。这些生长因子在神经保护，神经生成，血管生成发挥重要作用。研究发现将NSCs移植入MCAO模型的脑室内，14日后BDNF与VEGF含量与对照组比较显著增高[16]。本实验westernblot的检测结果中HBO+NSCs组与NSCs组，Cyy+NSCs组相比海马caspase-3表达量下调，同时realtime-PCR检测海马BDNF与VEGFmRNA表达量的结果中，HBO+NSCs组中海马BDNF与VEGF的mRNA表达明显高于NSCs组和Cyy+NSCs组.这表明HBO促进NSCs迁移的原因可能与促进神经生长因子的分泌，抑制新生细胞的凋亡有关。

同时移植的时间点与HBO治疗的时间点都是影响移植细胞存活率的重要因素。杨东波等的研究显示缺血后24h后移植的细胞存活率、增值程度和定向迁移都更加明显，而这一时间窗刚好与这些细胞因子分泌高峰相吻合因此考虑脑缺血后分泌的营养因子和趋化因子在24小时较多[17]，可能对随后移植细胞的存活、增值和迁移有重要的作用。有报道提示缺血缺氧性脑损伤后24小时治疗HBO治疗可显著促进Nestin蛋白的表达，提示HBO治疗可以促进内源性NSC的增值，这种作用至少可延长至脑缺血后24小时。而缺血缺氧性脑损伤后48-72小时正是凋亡与坏死的高峰期，小胶质细胞增殖并释放炎性介质,可引起新生NSC的凋亡或死亡,不利于脑组织的修复。因此本实验选择再灌注后24小时做为移植时间点并且移植后尽快行HBO治疗，尽可能提高移植细胞的存活率。

综上所述，HBO可以更好的促进GFP-标记的NSCs在MCAO模型大鼠脑组织内的迁移，其促迁移机制可能与HBO可以促进神经生长因子，抑制新生细胞的凋亡，减轻炎症反应有关。

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