远端缺血预处理对心衰大鼠心肌缺血再灌注损伤后心电图及心肌细胞形态的改变

易美玲1王元星2

南华大学附属第一医院心胸血管外科421001

摘要：分析远端缺血预处理对心衰大鼠心肌缺血再灌注损伤后心电图及心肌细胞形态的改变。方法：建立SD大鼠心衰模型、远端缺血预处理（RemoteIschemicPreconditioning，RIPC）模型，成功入组SD大鼠19只，分为：正常（n=5）、心衰（n=7）、RIPC（心衰+RIPC，n=7）三组，均行心肌缺血再灌注损伤后观察缺血30min过程中三组SD大鼠ECG的变化，再灌注2h后观察三组心肌细胞的形态学改变。结果：阻断后3-5min内，三组大鼠心电图ST段均显著抬高，与阻断前相比差异显著（P<0.01），30min达到峰值；与心衰组比较，RIPC组缺血期ST段抬高速度减慢、幅度降低（P<0.01）。三组心肌HE染色：正常组心肌横纹较清晰，少量肌束断裂，大部分细胞膜完整，胞浆轻度混浊，轻度嗜伊红染，大部分细胞核膜清晰，少量红细胞渗出，中度炎细胞浸润。心衰组：心肌横纹消失，肌束断裂，大部分细胞膜不完整，胞浆混浊，嗜伊红染色加深，部分细胞核溶解、消失或呈碎片状，间质充血，大量红细胞渗出及炎细胞浸润。RIPC组：心肌横纹尚清晰，少量肌横纹消失、肌束断裂，大部分细胞膜完整，胞浆中度混浊，中度嗜伊红染，少量细胞核溶解，细胞间质充血，少量的红细胞渗出及中度炎细胞浸润。结论：RIPC能显著降低心衰心肌缺血期的心律失常的发生率和程度和减轻心衰心肌细胞损伤的数量及程度，进而起到保护心肌作用。

关键词：远端缺血预处理；心力衰竭；缺血再灌注；心肌保护

远端缺血预处理（RIPC）对心肌缺血/再灌注（Ischemic/ReperfusionI/R）损伤的保护作用，是近年来学界研究的热点。临床上大多数心外科手术患者术前已处于不同程度的心力衰竭状态，打而心力衰竭是影响手术成败和远期效果的重要因素。尽管有多种药物和方案可以改善心功能，但均无法主动加强心肌对I/R损伤的耐受力。缺血预处理（IPC）被认为能提高心肌对再灌注损伤的耐受能力[1]，为外科手术提供了心肌保护的新途径；但因干扰手术操作、增加主动脉壁损伤等隐性风险未能形成手术常规。RIPC规避了需要短暂多次阻断升主动脉、干扰手术操作、另需药物诱导等潜在的风险，以完全无创、操作方便、无需特殊器械或增加用药等优点在IPC的基础上拓展了主动性心肌保护的可行性。本研究通过建立压力负荷性慢性心力衰竭SD大鼠模型，在此基础上进行RIPC，进而与正常心肌组共同进行I/R实验，观察记录ECG的变化，HE染色观察I/R后心肌细胞的形态学改变，评价RIPC对SD大鼠心衰心肌I/R损伤的影响，初步探讨RIPC对心衰心肌的保护作用及机制。

1.材料与方法

1.1实验材料：鼠龄相同，健康雄性SD大鼠81只（南华大学动物部，许可证号：SCXK湘2010-0004），体重250-350g/只。随机分笼为三组，鼠笼编号。实验中用于练习建立心肌I/R模型的动物数21只，因各种原因死亡的动物数24只，心衰模型成功动物数22只，最终纳入统计的动物数19只。

1.2试验分组：正常组：5只，体重416-443g，行心肌I/R处理；心衰组：7只，体重403-436g，行心衰+心肌I/R处理；RIPC组：7只，体重426-456g，行心衰+RIPC+心肌I/R处理。

1.3模型建立：慢性心力衰竭大鼠模型：麻醉，腹膜后位游离肾动脉上方的腹主动脉段，“7”号注射器针头磨去针尖，弯曲成“7”字型，将游离段腹主动脉和“7”型注射针头平行外科结绑定，关笼继续常规饲养3个月，心脏超声证实有左心室肥厚及射血分数降低（每一心动周期取值3次，取其平均值，以LVEF＜45%）作为心衰模型成功建立标准。心肌I/R损伤模型：用BL-420F生物机能实验系统连续监测Ⅱ导联ECG（定标扫描速度100mm/s，1mV=10mm）。气管切开插管，连接小动物呼吸机，开胸后启动呼吸机，在胸骨左缘切口，“T”型剪开心包，双“10”号丝线行左冠状动脉前降支结扎30min后恢复血流灌注120min，是为心肌I/R损伤模型。以同步心电图出现ST段进行性抬高[3]及左室前壁变白为阻断成功的标志，以同步心电图ST段逐步恢复及左室前壁逐渐变红为再灌注成功的标志。远端缺血预处理模型：心肌I/R损伤前12h于大鼠左下肢大腿中部无弹性棉质绳带捆绑结扎，以远端肢体动脉搏动消失、末端温度下降，皮肤发绀为缺血标准，持续5min。解除棉绳，触及动脉搏动、肢体远端温度回升、皮肤转为潮红为再灌注标志，持续5min。如此交替反复实施3次，麻醉复苏后关笼。

1.4观测指标：连续监测Ⅱ导联ECG，在再灌注120min末，取心尖部的心肌组织常规HE染色，观察心肌细胞的形态学改变。

1.5统计学方法：本研究所采集的数据均应用SPSS19.0统计学软件进行分析处理，计量资料以（±s）表示，行t检验；计数资料采用%表示，行χ2检验；显著性检验水平a=0.05，P<0.05有显著差异，P<0.01有高度显著差异。

2.结果

2.1RIPC对心衰大鼠心肌I/R损伤后心电图的改变

使用BL-420F型生物机能实验系统，选择心电信号通路，定于Ⅱ导联，设置参数（电压1mv，相当于10mm，扫描速度100mm/s），分别于麻醉稳定后、心肌缺血前0min，心肌缺血后15min、30min，再灌注30min、120min记录心电图变化。

2.2RIPC对心衰大鼠心肌I/R损伤所致心电图ST段变化的影响

经统计显示，与阻断前比较，阻断后的3-5min内，三组动物的ST段均显著抬高（P<0.01）；同时，随缺血时间的延长，三组的ST段都呈进行性增高的趋势，并在缺血后的30min达到峰值。与心衰组比，RIPC组的缺血期ST段的抬高幅度降低，抬高速度减慢（P<0.01）。再灌注之后，三组的ST-段均逐渐降低，至再灌注30min时，已基本恢复至阻断前水平，各组之间无显著性差异。（见表1）

3讨论

3.1.RIPC对心衰大鼠I/R损伤所致心肌电生理紊乱的保护作用

ECG是临床上最常用的缺血性心脏病诊断方法之一，随心肌缺血或梗死的部位和程度不同而表现出不同的图形。急性心肌梗死时ECG可表现为一系列的心肌缺血、损伤和坏死的变化，特征为T波异常、ST段抬高、双向或下降和病理性Q波的出现。ST段改变可在心肌缺血后立刻出现，表现为ST段偏移或形态的变化。急性心肌梗死的ST-段抬高机制的学说有两种[7]：（1）舒张期损伤学说：由于心肌受到损伤，损伤的细胞膜表面静息电位降低甚至消失，在全部的心肌复极完成后损伤的心肌与正常心肌之间形成了电位差，产生了舒张期电位，即从非损伤区流向损伤区的电流；这一电流反映在心电图上则是T-P段的降低，而ST-段仍处在等电位上，相对T-P段而言ST-段抬高。（2）收缩期损伤学说：心肌损伤后，正常心肌除极时，损伤心肌却处于早期复极过程中，其细胞膜表面的电位为正电位，从而产生方向从正电位的损伤区流向未受损区的电流，即收缩期电流，导致ST-段上抬。

实验中，三组动物室性心律失常均多发生于阻断缺血期，开放再灌注后均极少发生。阻断30min可使心衰组大鼠心肌的电生理活动发生严重的紊乱，与正常组相比，ECG表现有ST段快速、进行性抬高，VPC、VT出现早、持续时间长，各种VA发生率增高。RIPC后缺血期ST段上升速度减慢，抬高幅度降低（P<0.01）；缺血后VPC、VT的发生时间延迟1倍，持续时间缩短50%（P<0.05），VPC的发生率降低近1/3（P<0.01），VT发生率降低1/2（P<0.01）。这一结果说明：RIPC亦可改善心衰心肌对急性缺血的耐受，减轻缺血期间心肌电生理功能紊乱，对心衰心肌具有保护作用。但开放再灌注后，ST段改变恢复至阻断前水平，可能是我们对I/R损伤所致心脏电生理紊乱仅观察2h，未能观察到峰值时段，此为缺憾，有待进一步研究。

3.2RIPC减轻心衰大鼠心肌I/R损伤所致炎症反应和抗心肌细胞损伤和坏死

Kharbanda等发现，健康青年志愿者左上臂的5min缺血/5min再灌注三个循环的RIPC，可阻止血管内皮功能障碍和中性粒细胞激活，减少了I/R后循环血中性粒细胞激活相关因子（CD11b）的表达和血小板一中性粒细胞复合物形成，证实了RIPC对血管内皮功能的保护作用。同时，Szabo等研究发现，经典的缺血预处理可诱导再灌注期毛细血管后微静脉中的白细胞滚动和粘附，与其可显著增加中性粒细胞激活因子（CD11b和ICAM-1）的表达相关联。Konstantinov等的实验证实RIPC可降低CD11b的表达，抑制促炎基因Egr-1、Dusp-1和Dusp-6的激活，减少参与炎症反应过程的蛋白合成与释放。

结合本实验的心肌组织HE染色结果：与心衰组相比，RIPC组心肌形态学表现为中性粒细胞浸润、红细胞渗出明显减少，肌横纹溶解和肌束断裂程度减轻。由此分析：减少中性粒细胞浸润可能是RIPC对心衰心肌I/R后损伤的保护作用机制之一。红细胞渗出减少，间接证实RIPC对血管内皮功能稳定的维护作用。肌横纹溶解和肌束断裂程度减轻，亦可说明RIPC能减轻I/R对心衰心肌细胞的损伤和坏死程度。但由于实验中心肌标本数量的不足和技术条件的限制，仅观察了再灌注2h末心肌HE染色的结果，未能观察更长的再灌注后所致的心肌细胞形态学改变。亦未能测定心肌梗死面积、心肌细胞凋亡及凋亡相关因子的转录和蛋白水平的表达；此外，肌横纹溶解和肌束断裂程度减轻的相关机制也有待进一步研究。

参考文献：

[1]季永，喻田，李宗权，等.缺血预处理对大鼠离体缺血再灌注心脏心肌功能和线粒体ATP敏感性钾通道的影响[J].中华麻醉学杂志，2006，26（3）：238.

[2]吴振军.心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡与肺血管结构改变及药物干预的研究[D].北京：中国协和医科大学，中国医学科学院，2004.

[3]郭志坤，史福军，朱武岭.大鼠心脏缺血再灌注对心肌基质金属蛋白酶-1的影响[J]，解剖学报，2007，38（3）：359-363.

[4]姬尚义，沈宗林.缺血性心脏病[M].北京：人民卫生出版，2005：58-59.

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基金项目：湖南省卫生厅科研项目（B2013-42）