酶法提取垂盆草总黄酮的研究

方荣荣管宁程盼霞

（山东丹红制药有限公司山东菏泽274000）

【摘要】酶法在中药提取中的应用已经显现出明显的优势,并且越来越受到人们的重视。酶法用于中药提取可以破坏植物细胞壁,有利于对有效成分的提取,故酶法不失为一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一,是一项很有前途的新技术。

【关键词】总黄酮；酶法；垂盆草；含量

【中图分类号】R284.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2019）01-0326-02

本论文介绍了中药垂盆草的化学成分、黄酮类化合物的药理作用及其提取方法，并较为详细地介绍了实验方案的设计、原理、实验方法和步骤。

1.实验目的

通过对近年来国内外文献的系统查阅和综合分析，发现垂盆草中黄酮类化合物的提取方法很多，有水提法，醇碱提取法，超声提取法，半仿生提取法，微波辅助提取法等。但是发现很少有人用酶法作为预处理来提取，酶法提取已经发展为中药提取的一个重要方法。因此，本文将用酶法提取垂盆草中的黄酮类化合物，并确定最佳的提取条件。

2.垂盆草总黄酮水提与酶法提取的比较

水提法：称取20克垂盆草药材，用400ml温水浸泡30分钟，然后在电热套上微沸提取2小时。提取完后过滤，滤液在电热套上浓缩至浓度为1g/ml。

酶法：称取20克垂盆草药材，用400ml温水浸泡30分钟，同时0.08克复合酶用40℃温水活化5～10分钟。调解温度到50℃，pH值到4.0，缓缓加入酶液并轻轻搅拌，恒温酶解120分钟。酶解完后，在电热套上微沸提取2小时，提取完后过滤。滤液在电热套上浓缩至浓度为1g/ml。

2.1垂盆草总黄酮酶法提取条件的优化

2.1.1正交实验设计

根据查阅的国内外文献分析总结及垂盆草总黄酮的提取过程，设计分别以提取温度、酶解pH值、酶用量、酶解时间4个实验条件作正交实验并确定垂盆草总黄酮的最佳提取条件。

2.1.2垂盆草总黄酮的提取

称取20克垂盆草用400ml温水浸泡30分钟，同时复合酶用40℃温水活化5～10分钟。调解温度和pH值到需要值，缓缓加入酶液并轻轻搅拌，恒温酶解所需时间。酶解完后，在电热套上微沸提取2小时，提取完后过滤，滤液在电热套上浓缩至浓度为1g/ml。

2.1.3垂盆草总黄酮的含量测定方法

2.1.3.1测定波长的选择用UV762紫外/可见分光光度计扫描总黄酮样品，在510nm波长处扫描时，吸光度最大，所以选择510nm作为本实验含量测定的波长。

2.1.3.2标准曲线的绘制精密量取标准液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，具塞试管中各加30%乙醇，使为5ml，各精密加入5%NaNO2溶液0.7ml，摇匀放置6min，再各精密加入10%Al（NO3）3溶液0.7ml，摇匀放置6min，加入1mol/ml的NaOH溶液10ml，分别加30%乙醇稀释至25ml，摇匀放置15分钟，用紫外分光光度法在510nm波长下测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以30%乙醇试剂调零，测定各溶液的吸光度A值。

2.1.4垂盆草总黄酮的干浸膏测定蒸发皿做恒重处理，然后取各个提取液5ml，在水浴上制成干浸膏。得干浸膏后，测恒重。恒重的方法：105℃烘箱中干燥3小时，取出置于干燥器中冷却30分钟，迅速精密称重。供试品连续两次干燥后的重量差异应该在0.3mg以下。

2.1.5酶法最佳提取条件验证实验

根据正交实验得出的最佳提取条件做三组相同提取实验对正交实验进行最佳提取条件的验证。

2.2实验结果与讨论

2.2.1垂盆草总黄酮酶法与水提法比较的结果

酶法提取明显比单纯的水提法的总黄酮的得率要高。下面采用正交实验对垂盆草总黄酮的酶法提取条件进行优化。

2.2.2垂盆草总黄酮酶法提取条件优化的结果

由于实验所用垂盆草都是20g，因此可以根据UV762紫外/可见分光光度计测得的吸光度值A，利用标准曲线的回归方程可以算出提取液中总黄酮的得率。

2.2.3方差分析

垂盆草总黄酮粗品提取的四个因素用A、B、C、D表示。不同组合方法是水平，分别记作A1，A2，A3，A4.B1，B2，B3，B4.C1，C2，C3，C4，D1，D2，D3，D4。对垂盆草总黄酮得率和干浸膏得率进行综合评分的因素直观分析结果。所得均值数据分析，可知提取条件为酶解时间90分钟、pH值6.0，酶解温度50℃，酶用量0.4%时，垂盆草总黄酮的得率最高。

3.结论

本实验在不加酶的情况下单纯用水提，发现总黄酮得率比较低，酶法提取使其得率明显提高。

本实验以垂盆草总黄酮得率和干浸膏得率为指标，综合评分优选酶法提取的最佳条件。对酶法提取垂盆草总黄酮进行正交实验设计，采用四因素三水平正交设计，并结合对考察指标的综合评分结果发现A（温度）对提取结果的影响最为显著，其次是D（酶解时间）、C（酶用量）和B（pH值），最佳的提取工艺是A2B3C2D1，即酶解时间90分钟、pH值6.0，酶解温度50℃，酶用量0.4%。该实验得到垂盆草总黄酮的酶法提取条件简便经济，进行垂盆草工业化生产时可以参考。

【参考文献】

[1]公衍玲,黄山,于慧荣.垂盆草总黄酮的酶法提取及其抑菌活性[J].药学实践杂志,2010,28(2):114-115.

[2]潘金火,潘萍.垂盆草总黄酮的保肝降酶作用及其化学成分的鉴别研究[J].时珍国医国药,2010,21(8):1930-1934.