荧光原位杂交在非肌层浸润行膀胱尿路上皮癌术后随访中的应用

丁雪飞1高雄*高鹰2周广臣1

丁雪飞1高雄*高鹰2周广臣1

1.江苏省苏北人民医院泌尿外科扬州225001

*陕西省铜川市耀州区人民医院急诊科铜川727000;

2.江苏省苏北人民医院妇产科扬州225001

作者简介：丁雪飞,医学博士。高雄,并列第一作者。

【摘要】目的:研究多色荧光原位杂交探针（FISH）在非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后监测的应用价值，并与尿细胞学检查相比较。方法:应用FISH和尿细胞学检查分析215例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌术后随访尿沉渣标本。FISH探针是用随机引物法标记3、7、17号染色体着丝粒及9p21区带。比较分析两种检查结果。结果:215例中有58例患者病理证实膀胱尿路上皮癌复发。FISH对膀胱尿路上皮癌诊断高于尿脱落细胞学检查（71.4%和26.2%），并有统计学差异（P<0.05）；特异性分别为90%和95%，无统计学差异；阳性预测值分别是95.5%和95.7%，阴性预测值分别为52.9%和34.5%。结论:FISH检查可以作为非肌层浸润性尿路上皮癌术后随访的手段，并且敏感性高于尿细胞学检查。

【关键词】膀胱肿瘤；尿路上皮癌；多色荧光原位杂交；尿细胞学检查

【中图分类号】R746.2【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2010）09-0154-02

四色探针(fluorescenceinsituhybridization,FISH)，在国外广泛用于尿路上皮癌的研究[1]，国内尚未见其应用于膀胱尿路上皮癌术后随访的报道。本研究将探讨其在膀胱尿路上皮癌术后随访中应用的可行性。

1材料和方法

1.1标本收集:2008.6~2010.1我院泌尿外科门诊及病房共有215例非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌常规随访患者，男144例，女71例，平均66.4岁（24~81岁），患者术后随访平均3.4年（3个月-10年），在膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤电切术前留取晨尿，行FISH检查及尿细胞学检查。

1.2FISH方法:按照美国Vysis公司UroVysion试剂盒说明书上操作[2]:

(1)尿液准备：收集50-200ml晨尿，KCl（0.075mol/l）低渗、固定液（甲醇:冰醋酸3∶1）3遍固定、离心，制成尿沉渣固定液。(2)玻片准备：用2×SSC（pH7.0）洗涤、蛋白酶消化、1%甲醛溶液固定后梯度乙醇脱水，室温晾干。(3)尿沉渣制片：尿沉渣固定液滴片，56℃环境中老化滴片30min或室温下过夜老化。(4)原位杂交：在73±1℃的70%甲酰胺变性液变性5min后玻片标本依次置于预冷的梯度乙醇中各3min梯度脱水，经自然干燥，45~50℃预热2~5min后与变性后的探针混合液（7μl杂交缓冲液+1μl去离子水+2μl探针）于42℃杂交过夜。⑸杂交后洗涤、观察：玻片经50%甲酰胺、2×SSC（pH7.0）及0.1%NP-40洗涤DAPI染色后，荧光显微镜下观察计数。

1.3FISH评估

FISH结果评估:

1.3.1阈值建立:20例健康人群每一个探针组合观察100个细胞。统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比。阈值=平均值（M）+3x标准差（SD），见表1。

1.3.2判断方法:3、7和17中的两个染色体的扩增,p16纯合性缺失者判断为阳性，见图1。

1.4尿脱落细胞学检查检查连续3天的尿标本，可疑结果计算为阴性。

1.5统计学分析：应用卡方分析，统计软件为SPSS13.0软包。

2结果

共收集到215例浅表膀胱尿路上皮癌术后随访晨尿标本。FISH检查需要重复留取标本有17例，4例因为严重血尿，13例因为标本中细胞学过少。血尿严重者可以采取留取新鲜尿液并在FISH过程中适当稀释，尿沉渣中细胞数少可以收集多次留取晨尿沉渣以增加细胞数量，这样能满足FISH的需要。这两种尿标本对尿细胞学检查结果无影响。58例患者发现膀胱占位，术后病理证实为尿路上皮癌，复发率为26.9%（58/215）。FISH和尿脱落细胞学诊断膀胱尿路上皮癌的敏感性分别为72.4%（42/58）和37.9%（22/58），有统计学差异（P<0.05）；特异性分别是90%（18/20）和95%（19/20），见表1。FISH和尿细胞学检查与膀胱尿路上皮癌病理分级与临床分期之间关系见表2。

注：检测值大于阈值，判定为阳性结果；如果检测值小于阈值，判定为阴性结果。如果等于阈值，加大观测样本细胞数目。

图1(A)FISH-阳性细胞核;(B)3号探针红色荧光，7号探针绿色，均有非整倍性扩增；(C)17号探针绿色，为非整倍性扩增；9p21缺失

3讨论

保留膀胱的非肌层浸润性尿路上皮癌术后有很高的复发率，随访尤为重要[3]。尿中标记物如NMP22、Quanticyte及端粒酶等可以提高尿细胞学敏感度，但特异性较低[4]。尿细胞学虽然属无创性检查并且特异性强，但其敏感性较差[5]。因此，临床上需要一种敏感性高、特异性强、客观的无创性随诊方法。FISH是一项利用标记探针直接在染色体定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，技术操作相对简单，重复性好、稳定，并具有较高效的敏感性和特异性。FISH(UroVysion)试剂盒是利用9p21区带和3、7和17号染色体着丝粒作为探针，对膀胱尿路上皮癌诊断有较为理想的敏感性和特异度[6]。在术后随访过程中，VanRhijn等[7]报道FISH用于膀胱肿瘤随访的平均敏感性79%(70%-86%)，平均特异性82%(66%-93%)。此研究中FISH的敏感性为72.4%，特异性为90%，与国外报道相似。结果显示FISH诊断低级别膀胱尿路上皮癌的敏感度是尿细胞学的两倍，而特异度相当。因为复发性膀胱尿路上皮癌多在随访过程中发现，其病程短、肿瘤直径小、临床分期较早，尿细胞学检查对其的敏感度较初发肿瘤更低，相比较而言FISH可能更适合膀胱尿路上皮癌术后随访。

影响FISH检查结果的一个重要因素是标本中细胞数目过少，不能达到FISH试验要求[4]。本研究中约6%患者因为尿沉渣中细胞数量不足而不能进行FISH检查，通过多次留取晨尿累积尿脱落细胞，可以解决这个问题。部分患者血尿较重，尿沉渣中含有大量红细胞，会影响试验结果，我们采用嘱患者多饮水，留取新鲜尿液方法，可以减少血尿对实验的影响。相比较而言，尿细胞检查受血尿及尿沉渣中细胞数目的影响较小。FISH阳性结果判断尚无统一意见[4]，本研究采用UroVysion试剂盒标准，是否适合中国人群尚需大量标本观察。

总之，因为非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌治疗的特点及高复发率，FISH作为一种无创性、高敏感性和特异性的检查方法，在临床上有着广泛的应用前景。

参考文献

[1]JonesJS.DNA-basedmolecularcytologyforbladdercancersurveillance.Urol,2006,67:35-47

[2]HallingKC,KingW,SokolovaIA,etal.Acomparisonofcytologyandfluorescenceinsituhybridizationforthedetectionofurothelialcarcinoma.Urol,2000,164:1768-1775

[3]LourdesM,MercedesMA,MaraJR,etal.ClinicalUtilityofFluorescentinsituHybridizationfortheSurveillanceofBladderCancerPatientsTreatedwithBacillusCalmette-GuerinTherapy.Europeanurology,2007,52:752-759

[4]SchlomerBJ,HoR,SagalowskyA,etal.Prospectivevalidationoftheclinicalusefulnessofreflexfluorescenceinsituhybridizationassayinpatientswithatypicalcytologyforthedetectionofurothelialcarcinomaofthebladder.JUrol.2010,183:62-67

[5]BasWG,HenkG,TheoH.CytologyandUrinaryMarkersfortheDiagnosisofBladderCancer.EuropeanUrology,2009,8:536-541

[6]HaddadFS.TheFISHtestforthediagnosis,surveillance,andprognosisoftransitionalcellcarcinomaofthebladder.MedLiban.2008,56:230-232

[7]vanRhijnBW,vanderPoelHG,vanderKwastTH.Urinemarkersforbladdercancersurveillance:asystematicreview.EurUrol2005;47:736-748