热休克胶质瘤源exosomes分离鉴定及相关蛋白组成的研究

曲新国吴丹艳王钦玉

曲新国1吴丹艳2（通讯作者）王钦玉1

（1湖北医药学院附属人民医院神经外科湖北十堰442000；2湖北十堰市妇幼保健院湖北十堰442000）

【中图分类号】R730.264【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）49-0030-02

【摘要】目的验证胶质瘤细胞可分泌exosomes,探讨热休克对胶质瘤细胞分泌的exosomes产量及相关蛋白的影响，为进一步研究增强exosomes免疫活性及体外实验提供理论依据。方法采用差速离心法结合超滤及蔗糖密度梯度离心纯化得到胶质瘤细胞分泌的Exosomes和经热休克处理后胶质瘤细胞分泌exosomes(HeatshockedExosomes,HS-Exo),电镜观察两组exosomes形态。westerrn-blot鉴定HSP70及ICAM-1表达。结果胶质瘤细胞及经热休克处理后均可分泌exosomes，直径约30-100nm,电镜形态无明显差别。经westerrn-blot检测热休克处理的细胞的HSP70及ICAM-1表达量增加，为进一步提高exosomes的免疫活性提供理论基础。

【关键词】胶质瘤exosomes热休克蛋白肿瘤疫苗

Exosomes作为一种亚细胞结构的外核体，是一种具有诱导机体产生抗肿瘤免疫效应，是新型的潜在的抗肿瘤疫苗。其中其蛋白分子HSP70及各种相关免疫分子的研究引起广泛的关注。HSP70-多肽复合物可以激活肿瘤免疫发挥抗肿瘤作用。胶质瘤也可以分泌exosomes,为增强exosomes免疫活性，我们对胶质瘤细胞进行热休克处理，不进行任何基因修饰，采用经典的差速离心法结合超滤和蔗糖重水超速离心法分离纯化exosomes,对其形态及免疫分子进行鉴定，探讨增强exosomes免疫活性的方法，为进一步研究胶质瘤疫苗打下基础。

1材料和方法

1.1实验材料

细胞及试剂：U251细胞购自上海细胞库DMEM(赛墨飞世尔生物化学公司)，Centriplus离心超滤管(100kd)Amiconultra高回收率高流速切向流超滤离管(100kd)PVDF购自Millipor公司，重水（青岛腾龙微波科技公司）兔抗人ICAM-1单克隆抗体购自SantaCrus公司，鼠抗人HSP70单克隆抗体BCA蛋白浓度测定试剂盒，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠,羊抗兔IgG购自碧云天生物研究所。

1.2实验方法

1.2.1U251胶质瘤细胞培养：DMEM培养基加10%胎牛血清（100000g超高速离心后使用）于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养U251胶质瘤细胞，每两天以0.25%胰蛋白酶消化，中间不予换液。注意观察细胞铁壁生长状况，选取对数生长期状态良好的细胞收集上清液约100ml。

1.2.2收集上清液：取状态良好的U251细胞进行热休克处理即42℃恒温中下培养2h，经反复试验先将恒温箱预热至37℃,将细胞培养瓶放置恒温箱中，然后升温至42℃热休克2h，然后将细胞置细胞培养箱中继续培养4h，光镜下观察细胞生长状态，收集细胞生长状态良好细胞上清液约100ml

1.2.3exosomes分离纯化：将收集的细胞上清液分别于4℃以300g10min，800g30min，1000g30min离心取上清液，然后通过100kd超滤离心管进行离心浓缩，以1000g30min得浓缩液约10ml，将浓缩液分别转移到30g/l蔗糖重水垫的离心管中10000g超速离心1h，收集缓冲垫PBS稀释至10ml,再置于100kdAmiconultra高回收率高流速切向流超滤离管中1000g30min分别得到约2mlexosomes-80℃保存备用。

1.2.4exosomes形态学鉴定：滴一滴exosomes悬液于载样铜网上，室温下静置5min，用滤纸从周边吸干后滴加2%磷钨酸溶液（PH6.8）负染2min，用白炽灯烤干约10min放置透射电镜下观察并拍照。

1.2.5BCA法蛋白浓度测定：按BCA法蛋白浓度测定试剂盒（增强型）说明，于96孔板添加适量标准蛋白及BCA工作液，于样品空添加适量样品定容，37℃放置30min上机测定A490波长，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

1.2.6westerrn-blot检测：（1）分别配制10%分离胶和4%浓缩胶，exosomes和HS-Exo经蛋白浓度测定后调整成等量上样量与5×SDSloadingbuffer混匀，marker一起,100℃加热变性5min，上样每空30μl。（2）电泳：浓缩胶恒压80V，当到达分离胶时变为120V。（3）转膜：将分离胶中蛋白质通过湿法电转移方法转移至PVDF上。(4)封闭：将PVDF膜放在TBS缓冲液中，洗涤5分钟，将膜正面朝上，放在装有含5%脱脂奶粉封闭液的平皿中，室温摇床轻摇1小时。（5）与一抗结合：将HSP70，ICAM-1一抗（10μl）用封闭液按1:200进行稀释，与膜一起于封闭的塑料袋中4℃轻摇过夜：（6）与二抗结合从封闭塑料袋中取出膜，用TBST缓冲液充分洗膜3次,每次10min。再与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠，羊抗兔LgG（2μl用封闭液按1:1000稀释）放入封闭的袋子中，室温轻摇2h。（7）显色：膜用TBS洗涤3次，每次10分钟,ECL增强发光试剂显色后,于凝胶成像系统曝光,显影定影后观察结果,采用QuantityOne软件对图象进行光密度分析。

1.3统计学分析

统计学处理试验重复3遍采用SAS8.0软件进行统计学分析,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1exosomes电镜形态观察

胶质瘤细胞来源的Exosomes及HS-Exo均为囊泡结构，镜下其直径大约在30-100nm，在大小形态上没有明显差别，多为圆形，中间呈光亮区，周边暗染。

2.2westerrn-blot法Exosomes和HS-Exo蛋白成分的分析

采用QuantityOne软件对图象进行光密度分析采用t检验,P<0.05，差异有统计学意义。

3讨论

Exosomes是由多种细胞分泌的膜性囊泡状结构，具有免疫调节能力，可激发有效的抗肿瘤免疫反应，其中肿瘤细胞分泌的Exosomes具有天然的肿瘤抗原，可以将肿瘤抗原传给抗原提呈细胞，发挥抗肿瘤效应。因此肿瘤细胞来源的Exosomes可作为肿瘤疫苗研究的新工具。最近有研究表明，运用IL-12对肿瘤细胞进行基因修饰,基因修饰的肿瘤细胞分泌的Exosomes的免疫活性及体外诱导T细胞增殖明显增强以病毒为载体原位转染胶质瘤免疫基因治疗，在体外实验中小鼠生存期明显延长，然而基因免疫治疗费时费力，周期较长。热休克蛋白能结合并携带并递呈内源性抗原多肽。能够诱导特异性的抗肿瘤生长的保护性免疫反应。而热休克处理可诱导热休克蛋白的高表达,热休克蛋白具有的免疫佐剂效应和提高肿瘤细胞免疫原性的作用参与机体抗肿瘤免疫反应。我们在此基础上对肿瘤细胞进行热休克处理，提取热休克肿瘤细胞来源的Exosomes，并对其相关免疫分子进行检测。

本实验中我们采用差速离心和蔗糖密度梯度法，以及超滤三者相结合的方法分离纯化Exosomes，与以往的单一方法相比分离得到的Exosomes纯度提高，电镜鉴定两者形态与以往报道相似，两者在形态上无明显差别，BCA法对其总蛋白进行测定，热休克Exosomes比正常Exosomes蛋白含量明显增高，说明热休克可以增加Exosomes产量。Exosomes所含有的热休克蛋白为HSP-多肽复合物，已成为目前抗肿瘤免疫治疗的新热点，可有效激发T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。ICAM-1为一种粘附分子，在细胞间识别活化及信号传导中起作用，介导T细胞和NK细胞杀伤作用，其含量增加在免疫功能中起重要作用。

本实验结果提示，运用简单的热应激反应，可有效提高Exosomes相关免疫分子含量，此方法不采用任何基因或其他外来因素修饰，操作方法简单，为进一步研究Exosomes及提高其免疫活性及胶质瘤免疫治疗提供理论依据。

参考文献

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