川芎嗪对过氧化氢造模的HUVEC保护作用机制研究

唐振宇

唐振宇（江苏省常州市第一人民医院骨1科常州213003）

作者简介：唐振宇，男，1975，江苏常州人，主治，硕士，从事骨科临床研究常州市第一人民医院骨1科。

【摘要】目的：研究川芎嗪对HUVEC的凋亡相关分子的影响,探讨其对HUVEC的作用机制。方法：用H2O2构建凋亡模型，运用MTT及流式细胞仪检测细胞活性，线粒体膜电位改变，激光共聚焦测定钙离子浓度。结果:川芎嗪可以稳定线粒体膜电位，减少钙离子内流，增加细胞的活力。结论:川芎嗪对HUVEC有一定的保护作用。

【关键词】川芎嗪；过氧化氢；HUVEC；作用机制

【中图分类号】R285.5【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0120-02

目前，老年性退行性病变已成为城市老年居民的主要疾病，因此，积极治疗老年性退行性病已成为当前医学的热点。血管内皮细胞是血管的主要结构，有着广泛的生理功能，防治老年性退行性疾病发生，减少骨坏死的发生。麝香出自雄麝脐部和阴部之间的腺囊内，是引诱雌麝的分泌物。川芎嗪是活血化瘀类中药川芎的单体，常应用于缺血性疾病。因此，我们观察川芎嗪对H2O2造模HUVEC的细胞周期、线粒体膜电位、Ca2+的变化等方面来探讨川芎嗪可能的作用机制，从而治疗缺血性骨坏死。

1材料和方法

1.1药物：川芎嗪由南京药科大学提供，并通过氢谱和质谱鉴定。

1.２主要试剂与仪器：Rh123(Sigma，USA)、Fluo3/AM(CALBIOCHEM，Ca)，PI(Sigma，USA)，RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)(每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、链霉素100U、pH7.4)；胰蛋白酶(MERCK，USA)；二甲基亚砜(DMSO)(Merck，Germany)；6孔细胞培养板（Costar，Denmark）；细胞培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，JAPAN)；流式细胞仪(BD，USA)，激光共聚焦显微镜（Leica,TCS-SP5）。

1.3实验方法

1.3.1血管内皮细胞的体外培养:人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)，购于南京中医药大学海洋药物研究中心，根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法(PAP法)染色细胞第Ⅷ因子相关抗原呈阳性，确定培养细胞为内皮细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养传代。

1.3.2实验分组:实验分为5组：（1）正常对照组（无任何诱导物）；（2）模型组（含终浓度为200μmol/lH2O2的无血清培养液），（3）川芎嗪低剂量组（200μmol/lH2O2＋川芎嗪终浓度为0.5mmol/ml）；(4)川芎嗪中剂量组（200μmol/lH2O2＋川芎嗪终浓度为5mmol/ml）；(5)川芎嗪高剂量组（200μmol/lH2O2＋川芎嗪终浓度为50mmol/ml）。作用时间为24h。

1.3.3MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法测定细胞活力:将培养至第3代的HUVEC用0.25%胰酶消化后,吹打制成单个细胞悬液(调整细胞密度为1.0×104),分别接种到96孔板中。每块96孔板1～2列为不含细胞的血清,以消除血清物质对光吸收值的影响；3～4列为HUVEC细胞悬液；5～6列为HUVEC和H2O2细胞悬液；7～8列为川芎嗪低剂量细胞悬液；9～10列为川芎嗪中剂量细胞悬液；11～12列为川芎嗪高剂量细胞悬液，放置于37℃、5%CO2的培养箱；24h后每孔加入MTT溶液20ul，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，小孔加入DMSO200μl溶解结晶物，振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。

1.3.4Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡:细胞数目为5×104-5个/ml，接种于６孔板中，加入过氧化氢和测试物，作用24小时，用PBS或Hank’s液洗涤细胞，固定液（甲醇∶冰醋酸3∶1）4℃固定5分钟，Hoechst33258染色10分钟，用蒸馏水洗片后经封片剂封片，用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。

1.3.5PI染色法检测细胞周期:以0.25%胰酶消化、收集正常组、模型组、川芎嗪各组作用24h后的贴壁细胞，以PBS洗涤3遍，弃上清液，加入PI染剂30分钟，流式细胞仪（FACSCalibur,USA）测定细胞平均荧光强度。测定后以分析软件CellQuest分析。

1.3.6激光共聚焦检测线粒膜体电位:收集各组细胞，细胞经胰酶消化，吹打成单细胞，取1×105细胞，PBS洗涤2次，加入Rh123储存至终浓度为10μM，室温下平衡30min，PBS洗涤2次，PBS稀释至细胞浓度为1×105/ml，上机检激发光波长为488nm，计数1×104个细胞，测定胞内相对荧光强度。

1.3.7激光共聚焦检测Ca2+变化:Fluo-3/AM用纯二甲基亚砜(DMSO)配成mmol/L的储备液,低温保存备用。pluronicF-127用DMSO配制成25%溶液(W/V)备用。实验前Fluo-3/AM稀释至5μmol/L，与0.025-0.125%pluronicF-127加于培养各组的HUVEC细胞样品上，置于5%CO2孵箱中孵育30分钟。将染色后的样品用D-Hanks液洗1次，置于20倍光学显微镜下，选择单个或2个细胞及其层面，再用激光共聚焦显微镜进行观察，激发强度为29％，绿色荧光通道：Gain1195，offset-0.5%。AM染色的HUVEC细胞内钙离子浓度变化时，荧光强度会发生变化，可记录到的HUVEC细胞内钙离子浓度变化某一层面的荧光图像。使用软件为TimeCourse(KinetImagingSoftwareforMRC-1024andMRC-1024UConfocalImagingSystems)、Excel及ConfocalAssi数据分析运用SPSS13.5进行单因素方差分析及t检验以及相关性分析。

2结果

2.1川芎嗪对H2O2造模的HUVEC细胞活力的改变:实验结果提示，经过氧化氢作用后HUVEC的OD值降低，使HUVEC的增殖降低(P<0.01)，川芎嗪组对HUVEC的OD值逐渐升高，以中、高剂量组最为明显(P<0.01)（见表1），说明川芎嗪能抵抗H2O2对HUVEC损伤，并呈一定的量效关系。

2.2Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡:实验结果显示，模型组HUVEC见大量的核碎裂，川芎嗪各组尤其高剂量组对H2O2造模的HUVEC有明显的保护作用(见图1)。

2.2川芎嗪抗H2O2造模的HUVEC细胞凋亡率的检测:采用PI对经不同浓度川芎嗪以及H2O2作用的HUVEC细胞进行染色，通过流式细胞仪检测，结果证实细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而减少，不同浓度川芎嗪分别作用于HUVEC24小时后，细胞凋亡率分别为正常组为（0.175±0.289）、模型组为（11.385±0.189）、低剂量组（8.23±0.103）、中剂量组为（7.46±0.44）、高剂量组（6.48±0.517）（见图2），说明川芎嗪抗HUVEC凋亡的作用，从而发挥抗心脑血管疾病的作用。

2.3川芎嗪对H2O2造模的HUVEC线粒膜体电位的改变:为了探讨川芎嗪件否通过激活线粒体依赖性通路，检测细胞线粒体膜电位。实验结果显示，经川芎嗪处理HUVEC细胞24小时，以Rh123作为荧光探针测定线粒体膜电位时，发现H2O2作用于细胞株24h后，细胞荧光强度减弱(4.54±2.26)，即细胞线粒体膜电位降低，药物作用后，细胞荧光强度增强(12.11±1.93)、（16.17±3.38）、(24.80±4.58)，即细胞线粒体膜电位升高，并呈一定的剂量关系（见图3）。

2.4川芎嗪对H2O2造模的HUVEC细胞内Ca2+含量的改变:为了进一步研究川芎嗪抗H2O2对HUVEC损伤的机制，我们对细胞内Ca2+含量进行检测，Fluo-3与HUVEC细胞中的游离钙离子结合后，激光束为激发下荧光不均匀的分布于胞浆中。H2O2可引起HUVEC钙超载，而引发细胞的进一步损伤，在成功地建立了HUVEC钙超载模型后，Ca2+荧光强度的变化曲线显示川芎嗪可缓解H2O2所致的钙超载，使胞内升高的钙值有所恢复，接近正常情况（表2）。

3讨论

血管内皮细胞位于血管内壁，能分泌多种血管活性物质，对血管舒缩、凝血与抗凝等多方面有着不可替代的调节作用，血管内皮细胞的损伤可导致其功能失衡以及细胞因子调节异常。目前，已知引起血管内皮细胞损伤的因素很多，如细胞因子、内毒素、自由基、TNF-α、炎症介质等，其中活性氧（ROS）引起内皮细胞氧化损伤是引起血管内皮功能障碍的一个重要原因[1-2]。因此，我们用过氧化氢为模型，研究川芎嗪对内皮细胞的保护作用机制研究。

线粒体是细胞内生产ATP的主要场所，在细胞凋亡、信号传导的发生过程中起着非常重要的作用。目前研究认为，线粒体跨膜电位具有维持线粒体内环境稳定、保证氧化磷酸化通路顺畅的作用。在活性氧的作用刺激下，线粒体的膜电位会丢失，线粒体的通透性会发生变化，各种凋亡因子会从线粒体释放到细胞质中，它们激活caspasae，从而介导细胞凋亡的发生[3-4]。

钙离子是胞内重要的第二信使，钙离子能够稳定细胞结构。钙超载可引起线粒体功能障碍及酶的激活，促进膜磷脂酶分解，产生脂肪酸、白三烯、溶血磷脂等，对细胞产生毒害作用。同时Ca2+还可激活钙依赖蛋白酶，促使胞内许多重要酶降解，同时也促进细胞骨架成分的降解，细胞塌陷，从而诱导细胞发生凋亡[5-6]。川芎嗪能稳定细胞膜结构，减少钙离子内流，防止细胞发生凋亡。

综上所述，川芎嗪保护血管内皮细胞凋亡与其稳定线粒体膜电位，减轻细胞通透性，防止钙离子内流增加相关。这一实验结果有利于川芎嗪单体治疗缺血性骨坏死的临床应用。

参考文献

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