环巴胺对胃癌细胞MC增殖凋亡的影响

冯广跃1闫慧明1孟鹏鹏2孙振卿1

冯广跃1闫慧明1孟鹏鹏2孙振卿1

1山西医科大学第二临床医学院普外科山西太原030000;

2晋城市矿务局总医院普外科山西晋城048000

【中图分类号】R969【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）24-0028-03

【摘要】目的研究Hedgehog信号通路阻断剂(环巴胺)对MC细胞增殖凋亡的影响。方法取对数生长期MC细胞分为环巴胺处理组及阴性对照组,以1、5、10μmol/L环巴胺处理MC细胞,分别在24、48、72h后采用MTT法检测其生长抑制率；流式细胞术检测对照组和10μmol/L环巴胺实验组对细胞周期的影响。结果环巴胺对MC细胞的抑制作用呈时效和量效依赖关系。1、5、10μmol/L浓度组对细胞的生存率分别为(50.03±14.02)%、(49.76±14.14)%和(37.87±19.53)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞术检测发现,环巴胺浓度达10μmol/L,干预24h后G1期细胞比例明显升高。对照组、10μmol/L浓度实验组的G1期细胞百分比分别为:33.94%、49.83%；细胞凋亡率对照组和10μmol/L浓度实验组分别为1.34%、7.09%。讨论环巴胺可以抑制MC细胞的增殖能力和诱导MC细胞凋亡的作用，其机制与抑制Hedgehog信号通路有关。

【关键词】环巴胺Hedgehog信号通路MC细胞周期细胞凋亡

环巴胺(cyclopamine)是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，因其致畸作用而于20世纪60年代被发现。Hedgehog基因在人类进化过程中高度保守，它最初是从果蝇(Drosophila)体内分离出的一种分节极性基因(segementpolaritygenes)，调节果蝇胚胎角质层的发育模式。之后的研究证实了日edgehog信号通路的失调参与了人类多种实体瘤的形成，包括胰腺癌、基底细胞癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等，并直接促进肿瘤的复发、转移和侵袭等一系列恶性生物学行为[1-5]。1998年，环巴胺作为一种Hedgehog信号通路的阻断剂在果蝇体中得到证实[6]。环巴胺可改变Hh通路的平滑蛋白(smoothened,Smo)的空间结构而抑制Smo的活性,是该通路的特异性阻断剂。最近研究发现，Hedgehog信号通路的异常激活可能与胃癌的发生发展有关[7]。MC细胞是本实验通过前期实验利用亚硝酰胺类化合物N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导人类胃上皮永生化细胞GES-1恶性转化后所得细胞[8]。目前国内外还没有关于环巴胺与胃癌细胞MC的关系研究。本实验旨在研究环巴胺对胃癌细胞MC的体外生长抑制及诱导凋亡作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

1材料和方法

1.1材料

MC细胞株由本实验室提供，环巴胺购自Biomol公司，DMEM及胎牛血清购自Gibco公司,FACSCalibur流式细胞仪购自美国BeetonDiekinson公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养MC细胞培养于含有10%胎牛血清DMEM培养基中，在5%CO2，37℃的环境中单层生长。每48h更换培养液，用胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2MTT法检测细胞增殖

(1)收获对数生长期细胞接种入96孔板，按2000个细胞/200?l培养液/孔，复设3孔，置于细胞培养箱中以含10%血清的DMEM培养液常规培养；

(2)分别在第24、48、72h天取出细胞进行MTT检测;每孔加入MTT溶液(10mg/ml)20μl，继续于37℃孵育4h后，吸弃上清;

(3)每孔加入150μlDMSO，室温下微板孔震动器上振荡10min以溶解结晶;

(4)在ELISA检测仪上测定各孔的A490nm值；

(5)设置仅含培养液不加细胞的孔作为空白对照，作为调零孔;

(6)以时间为横坐标，3复孔的平均光吸收值为纵坐标，记录细胞增殖情况，并进行统计学分析，以抑制率(IR)表示细胞生长抑制情况。IR=(1-处理组吸光度)/(阴性对照组吸光度)×100%。

1.2.3流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期

(l)获取对照组和10μmol/L环巴胺实验组[14]细胞，取l.5×105细胞于2ml离心管中，室温离心1500rpm×5min

(2)弃上清，收集细胞沉淀，预冷的PBS缓冲液轻洗2次，重悬细胞，

(3)加入75%预冷乙醇固定细胞，4℃过夜，避光保存;

(4)预冷PBS缓冲液洗去固定液，加入RNA酶，室温避光30min;

(5)再次离心，预冷PBS重悬后，Pl染色，4℃避光30min，上流式细胞仪检测细胞周期，并计算细胞凋亡率,细胞凋亡率=凋亡细胞数/检测细胞总数×100%。

1.3统计学处理

实验所得数据以均数加减标准差表示方差检验，利用SPSS13.0软件处理包进行统计分析。

2结果

2.1环巴胺对MC细胞的生长抑制效应

MTT法检测结果显示，1-10μmol/L-1的环巴胺对MC细胞有生长抑制作用，呈时间一剂量依赖性其生存率(见表1)，各组之间的差异有统计学意义(P<0.001)。

表1

2.2环巴胺对胃癌细胞MC增殖凋亡的影响

流式细胞术检测细胞周期发现，10μmol/L浓度的cyclopamine处理MC细胞后,与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著增加(49.83%vs33.94%)，而S期细胞比例显著减少(31.56%vs42.85%)见图2。

图2

实验组和对照组细胞凋亡率分别为7.09%，1.34%。见图3,4

图3图4

3讨论

Cyclopamine是Hh信号通路的特异性阻断剂，是一种提取自山黎芦的拼体类生物碱，可与smo特异性结合从而使Hh信号通路失活。在20世纪60至80年代，人们对环巴胺的研究仅限于其在胚胎发育期的致畸作用；最近研究发现，环巴胺在成体中具有抗肿瘤作用，且在胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、肝癌等的体内或体外实验中均得到证实[9-12]，但关于其在胃癌细胞MC中的研究，国内尚未见相关报道。

Hh通路对人胚胎发育过程中的细胞增殖、分裂、极性分化和迁移起重要作用,肢体、脊索、脑、肺、面部、毛发、牙齿、睾丸和骨的发育有赖于HH信号。信号中的蛋白分子的突变可能导致发育缺陷,如前脑无裂畸形、多指趾畸形、颅面部缺陷及骨骼畸形等[13]。异常的HH通路激活已经证实与多种肿瘤,如基底细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和乳腺癌等有关[14]。

本研究以胃癌细胞系MC为细胞模型，探讨环巴胺对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。MTT法结果显示，环巴胺对MC细胞有增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性，其中剂量效应关系较显著。环巴胺剂量低于1μmol·L-1时，对细胞抑制作用不明显；当剂量从5μmol·L-1增至10μmol·L-1时，随着剂量的增加和作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强。随着环巴胺浓度增加凋亡峰也随环巴胺浓度增加而逐渐增高尤其当环巴胺浓度>10μmol/L时MC细胞的凋亡更明显[15]，同时为了验证这一现象，我们应用流式细胞仪检测了MC的细胞周期和凋亡情况。细胞周期以DNA复制和分裂作为主要标界，按时间顺序分为四个期:DNA合成前期(Gl期)，DNA合成期(S期)，DNA合成后期(G2期)、分裂期(M期)。在细胞分裂后进入Gl期前有一个相对静止期(GO期)。细胞增殖周期存在2个检验点:G1/S和G2/M，其中以G1/S检验点最为重要，一旦跨越细胞则可以不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程[16]。在细胞分化过程中，由于细胞成熟而不再分裂，细胞周期动力学方面常常表现为GO/G1期细胞增多，而S期减少。但是肿瘤细胞常常跨越Gl/S检验点，大量细胞处于S期，进行异常增殖，从而导致失控性生长。有研究报道环巴胺可以使细胞分裂停止于GO/G1期，抑制细胞增殖，并可能通过诱导细胞凋亡从而发挥抑制作用[17]。细胞凋亡(apoptosis)也称程序性细胞死亡(programmedcelldeath)，是由凋亡基因如CasPase家族和Fas受体家族介导的自身的破坏，它包括一系列的形态变化如:DNA程序性降解、染色质浓缩、细胞缩小并碎裂。该过程可以是生理性的，也可以是由化疗药物或放射线诱发所致。本实验证实加入环巴胺干预后，MC细胞进入GO/G1期细胞数显著增多，而S期细胞明显减少，而且经环巴胺干预的实验组细胞凋亡率明显高于对照组，表明阻断Hh信号通路后，可以抑制细胞由GO/G1期向S期转换，抑制细胞分裂，促进细胞凋亡，从而达到抑制细胞的增殖。

总之,环巴胺具有较强的抗胃癌作用,应用环巴胺抑制Hh信号通路或许能为胃癌治疗提供帮助。本实验通过阻断Hh信号通路,使MC细胞的增殖能力明显下降。这为今后实验提供了思路同时为治疗胃癌提供了新靶点。环巴胺可以诱导癌细胞MC凋亡但其机制有待于进一步研究。

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