伤寒沙门菌株耐药性与vipR基因RFLP和PFGE分型研究

肖群

肖群(解放军九四医院检验科330002)

【摘要】目的:监测伤寒沙门菌株对青霉素和其他抗生素的耐药情况。分析多重PCR基因扩增产物图谱与青霉素耐药性的相关性，分析血清型青霉素耐药菌株的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)图型，初步了解耐药菌株分子流行病学上的特点。方法:(1)抗生素药物敏感试验;（2）用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)结果发现23株多重耐药鼠伤寒沙门菌,其中耐4～5种抗生素的9株(40%)，耐6～9种抗生素的8株(35.13%)，耐10种抗生素的6株(26.10%);可分为16个PFGE型,其中5个PFGE型的菌株数超过1株。结论：伤寒沙门菌分离株的多重耐药性严重,PFGE分型方法对鼠伤寒沙门菌的分型能力较好。

【关键词】伤寒沙门菌;抗药性;微生物;聚合酶链反应;电泳;凝胶;脉冲场

【中图分类号】R378.24【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0043-02

近年来,细菌的耐药性已经成为一个非常普遍的现象,引起各国食品安全和医药工作人员的高度关注。，且由于目前抗生素的滥用等情况，故常被误诊为感冒、胃肠炎等疾病，误诊率较高。因此病原菌准确的鉴定及药敏试验非常重要。

1材料和方法

1伤寒沙门菌药物敏感试验

1.1伤寒沙门氏菌株的采集、分离和鉴定:

1.1.1标本来源：我院2007年送检的血培养标本中培养出的57例伤寒沙门菌

1.1.2镜检与培养：标本直接涂片革兰染色镜检见革兰阴性杆菌，同时接种在血平板和中国兰琼脂平板上，36℃，24h培养后观察，血平板上菌落直径约2mm-3mm圆形，光滑，湿润，不溶血；在中国兰琼脂平板上菌落无色，光滑，稍隆起，较透明，直径约1mm-3mm种培养基上均为纯培养，革兰染色为阴性杆菌。

1.1.3生化鉴定：O／F试验发酵型，氧化酶阴性，克氏双糖管底层产酸、斜面产碱、产H2S、动力阳性，可疑为沙门菌用法国梅里埃API20E系统鉴定为沙门菌属，可信率99.9﹪。

1.1.4血清学鉴定：沙门菌诊断血清系兰州生物制品研究所生产，A-F0多价凝集，04凝集，H凝集1.2.3.5,Hi凝集，该菌株符合鼠伤寒沙门菌。

1.2抗生素药敏试验检测方法为琼脂扩散法即K-B法，平皿中M-H琼脂定量加人，确保培养基厚度为4mm，至少挑选3-5个相同菌落接种在4-5ml适宜的肉汤中，置37℃培养2-6h，直至其浊度达到或超过0.5麦氏单位，超过者可用生理盐水稀释校正至0.5麦氏单位，在校正后15min内，以无菌棉试蘸取并在管壁内轻轻挤去多余的菌液后涂布整个平皿琼脂表面，交叉涂布2-3次，使接种均匀，然后放置室温3-5min后贴加药敏纸片，但不应超过15min，轻压纸片使与琼脂表面完全接触，相邻纸片中心至少相距24mm，贴完纸片后15min内，平皿应倒置放人35.9℃孵箱培养，16-18h判读结果。

1.3结果判定:根据美国国家实验室标准委员会(NCCLS)2000年版抗生素敏感试验标准(M1002S10)。

1.4质盘控制：每周做一次质控，确保菌株鉴定及药敏结果的准确性。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希氏菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。均由卫生部临床检验中心供应，每月更换1次。

1.5统计学处理:χ2检验,在SPSS(10.0)统计软件下分析数据,P<0.05时差异有显著性。

2聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)

2.1PCR引物购自上海生工生物工程公司:

上游引物GGTTTCATCATTTCAGGCCTCCA

下游引物CTCTGCTCCGTCAAGATCTTTTCACC

2.2PCR仪:PTC-100′TMProgrammableThermalController(MJResearchInc.)

2.3PCR流程:一接种环的伤寒菌加到300μl的0.85%盐水中,94℃孵育5min，离心去上清,加入50μlTE缓冲液和10U互构酶,37℃孵育10min。然后加热到100℃,3min。取2μl粗制伤寒菌溶解物为模板,加入引物、MgCl2、dNPT、×10缓冲液、TaqDNA聚合酶和蒸馏水,总反应体积为50μl。以94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环28次后,再延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,染色,紫外光下检测。

2.4限制性内切酶消化反应:取5μl扩增产物加入3UHaeⅢ限制性内切酶,37℃孵育20min。取消化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,染色,紫外光下检测,判断结果。

3脉冲电场凝胶电泳分型(PFGE)

3.1实验操作过程采用美国PulseNet标准操作手册(Pulse2Netprotocol)5.1、5.2、5.4规定进行[1]。

3.2结果判定:耐药结果参照NCCLS药敏标准进行结果判定,分为敏感(susceptible)、中介度(Intermediatesusceptible)和耐药(resistant)3种,可耐3种以上抗生素的为多重耐药株。

3.35～6个新鲜伤寒沙门菌落接种到5mlTHB培养基中孵育35℃,5h后,制成低熔点琼脂糖胶块。在溶解液中孵育35℃,过夜后,加入蛋白激酶K,50℃,24h，再加入SmaI，25℃,过夜。设定电泳条件:Switchtime:5～40s;电泳时间:23h;电泳角度:120°;电压:6V/cm;电流:100～120mA。进行脉冲电场凝胶电泳。染色,紫外光下检测,判断结果。

4结果

4.1伤寒沙门菌药物敏感试验

4.1.157栋伤寒沙门菌对8种抗菌药物的敏感率,见表1。

4.1.2耐药性测定结果:试验测得多重耐药株耐药谱如表2所示,共有23株多重耐药沙门菌,其中耐4～5种抗生素的6株(40%)，耐6～9种抗生素的5株(35.13%)，耐10种抗生素的4株(26.10%)。

4.2PCR扩增和限制性内切酶长度片段多态性分析

4.2.1使用特异性引物与经过加热法粗制的肺炎链球菌DNA模板进行PCR扩增,产生一个约1.5kb的高产量的vipR基因片段产物。

4.2.2RFLP分析:57株肺炎链球菌中青霉素敏感菌株为30株,不敏感菌株为27株。用限制性内切酶HaeⅢ消化这些菌株的PCR扩增产物后,经琼脂糖凝胶电泳后,有9种分型。谱与青霉素耐药性之间有较好的相关性。

5脉冲电场凝胶电泳分型

5.1所有菌株都可得到清晰的PFGE图谱,经过聚类分析,23株鼠伤寒沙门菌可分为16个PFGE型,分别命名为A～P型。其中K、L型各包括3株菌,A、B、C型各包含2株菌,D、E、F、G、H、I、J、M、N、O、P型均为1株菌。

5.2对比耐药性的测定结果：A型菌株抗生素耐药型菌株抗生素耐药谱一致,对所有测试抗生素均敏感。B型两个菌株耐药谱差异较大,K型各菌株耐药谱非常相似,L型菌株耐药谱也非常相似,其他种类抗生素的耐药结果均完全一致。

6讨论

沙门菌感染(如伤寒和副伤寒等)是常见的肠道传染病,并始终是发展中国家严重的公共卫生问题。对于沙门菌的检测,传统的微生物方法已经显现出很大的局限性,如检测周期长、步骤繁琐、许多因素难以控制等,分子生物学技术的进步和不断成熟以及技术服务市场化,使针对沙门菌开展的快速检测方法、分子和基因水平的研究得以迅速发展。

抗生素在临床和畜禽饲料中的普遍使用,对于减少许多感染性疾病的发病率和病死率,以及许多传染病的控制发挥了十分重要的作用,但细菌耐药及毒副作用问题日益突出,使许多抗生素失效,治疗失败。由耐药菌引起的沙门菌爆发流行,在发达国家和发展中国家都有发生[2～4]。

目前认为PFGE是分子指纹图谱的“金标准”,并且作为细菌亚型分型的标准方法已十分有效用于追踪世界范围的主要耐药克隆株的传播。但是,不能只用一种分子亚型分型技术和一种内切酶分析基因多样性,因为不同vipR基因的PRSP菌株能具有相同的PFGE图型。RFLP技术可靠、高效[5]。因此,抗生素分型、血清分型、vipR基因分型、vipR基因的DNA测序和PFGE代表青霉素耐药伤寒沙门菌分子生物学研究的主要潮流。

参考文献

[1]Pulse2Netprotocolsections5.1，5.2，5.4One2Day(24～28h)standardizedlaboratoryprotocolformolecularsubtypingofEscherichiacoliO157:H7，non2typhoidalSalmonellaserotypes，andShigellasonneibypulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE)[EBPOL].[2007-04-16]http:PPwww.cdc.govPpulsenetPprotocols.htm.

[2]王茂起,冉陆,王竹天,等12001年中国食源性致病菌及其耐药性主动监测研究[J]1卫生研究,2004,33(1):49-541

[3]冉陆1食源性致病菌及其耐药性[J].预防医学文献信息,2001,7(5):609-6121

[4]冉陆,张静.全球食源性疾病监测及监测网络[J].中国食品卫生杂志,2005,17(4):385-3861

[5]Bjorn2ArneLindstedt，EvenHeir.Avariationoftheamplified2frag2mentlengthpolymorphism(AFLP)techniqueusingthreerestric2tionendonueleases，andassessmentoftileenzymecombinationBglII2MfeIforAFLPanalysisofSalmonellaenterieasubsp[J].FEMSMicrobiologyLetters，2000，189:19-24