AfPGA催化合成头孢克洛工艺及其产物分离纯化实验分析

陈雷1,2刘铖2朱良兴2李贺然1（通讯作者）

陈雷1,2刘铖2朱良兴2李贺然1（通讯作者）

（1苏州大学医学部药学院江苏苏州215123；2苏州中联化学制药有限公司江苏苏州215212）

【摘要】目的本文通过实验考察了AfPGA催化合成头孢克洛的工艺及其产物的分离纯化方法，最终确定最优反应条件为：pH（7.0）；温度（25℃）；缓冲体系（磷酸钠）；酶投入量（3U/mL）；底物浓度（7-ACCA60mmol/L，苯甘氨酸甲酯120mmol/L）。在此条件下底物转化率将达到85%以上，产物纯度可超过99.5%，杂质含量低于0.5%。

【关键词】头孢克洛AfPGA工艺分离纯化

【中图分类号】R9【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）14-0117-03

CefaclorAfPGAcatalyticsynthesistechnologyandproductpurificationexperimentanalysis

【Abstract】thisarticlethroughtheexperimentinvestigatestheAfPGAcatalyticsynthesisofcefaclorprocessandproductseparationandpurificationmethod,finallytheoptimalreactionconditionsweredeterminedas:pH(7.0);Temperature(25℃);(sodiumphosphatebuffersystem);Enzymemass(3u/mL);Thesubstrateconcentration(7-ACCA60mmol/L,methylphenylglycinetendencyfor120/L).Undertheconditionofthesubstrateconversionratewillreachmorethan85%,productpurityover99.5%,impuritycontentlowerthan0.5%.

【Keywords】cefaclor;AfPGA.Process;Separationandpurification

头孢菌素是抗生素类药物中的重要一族，目前已研发到第4代，但比较而言，第2代头孢类抗生素对β-内酰胺酶稳定，对阳性菌和阴性菌具有良好又均衡的抗菌活性，其应用前景相对最佳。头孢克洛为第2代头孢类高效口服药物，其对肺炎球菌、溶血性链球菌、淋病奈瑟菌及厌氧菌等均具良好活性。但就头孢克洛的研制现状来看，既往采用头孢噻吩或是7-氨基头孢烷酸（7-ACA）作为原料均不十分理想，而在近些年来逐渐发展起来的生物化学、基因工程等技术为本品的合成指出了新的方向。粪产碱杆菌青霉素酰化酶（AfPGA）为青霉素酰化酶（PGA）家族中的一个独立分支，其不仅对底物亲和力好，而且对热、酸碱度以及多数有机溶剂等均可表现出较高稳定性，基于此，本研究即以AfPGA为原料，继而对其经催化合成头孢克洛的工艺进行了一定探索，一并研究了相关产物的分离纯化方法及效果。

1材料与方法

1.1材料

AfPGA、固定化载体（EupergitCM）、3-氯-7-氨基-3-头孢烯-4-酸（7-ACCA）以及苯甘氨酸甲酯等，其余相关试剂均采用分析纯。

1.2实验方法

1.2.1酶活力的测定采用对二氨甲基苯甲醛（PDAB）比色法，底物：青霉素G钾盐；底物溶液：以0.1mol/LpH8.0的磷酸钾缓冲液配制，最终浓度为40g/L，用酶在37℃条件下水解5min，以水解青霉素产生1μmol6-氨基青霉烷酸（6-APA）/min所需酶量为一个酶活单位（U）。

1.2.2固定化酶的制备与修饰对EupergitCM采用去离子水进行浸泡并洗涤，重复操作以将悬浮颗粒除尽为宜，之后即可将其置于缓冲液中并加入适量的游离酶溶液，再在低速摇床上反应一段时间，接着再用少量缓冲液进行多次洗涤，最后经抽滤即可得到固定化酶（IPA）。分别称取巯基乙醇（ME）与牛血清白蛋白（BSA）各25mg，以5ml磷酸钾缓冲液溶解后，再向其中加入1g（湿重）IPA，摇匀后室温状态保存20h，之后经抽滤即可得到修饰固定化酶（mIPA）。

1.2.3头孢克洛酶法合成和底物转化率测定将7-ACCA与苯甘氨酸甲酯混合均匀并充分溶解，之后再加入PGA，进而考察不同温度、酸碱度、投量等条件下的合成转化率，具体计算方法：在反应结束并进行离心处理后，采用PDAB比色法计算。

2结果与分析

2.1确定固定化AfPGA时间

以EupergitCM载体对AfPGA固定化处理，在350U/mL液态酶活力条件下，磷酸钾缓冲液浓度与酸碱度同上，投酶量以载体计：500～550U/g，温度：30℃，转速：150r/min。随固定化时间的延长，固定化速率鼠键升高，但在40h后不再升高（图1），故确定固定化AfPGA时间为40h。

2.3.2确定催化反应的最佳温度实验观察与检测结果显示，在25℃左右时，转化率达到最高，见图3，且该温度既不会因为过高而对AfPGA的产物稳定性造成影响，也不会因为过低而增加能耗与延长反应时间等，故将25℃确定为最佳反应温度。

基于上述多项实验，确定的催化反应条件其最终底物转化率可达到85%以上。

2.4产物在线分离与提纯

本实验选用树脂分离作为主要提纯方法，经进一步筛选后发现，尤以大孔吸附树脂的分离效果最佳，其吸附过程主要分为三个阶段：①分子经液膜扩散至树脂表面；②分子进一步在颗粒内扩散进而进入到树脂颗粒的内部微孔结构当中；③分子与微孔结构中的活性点位产生吸附作用。树脂的层析实验结果表明，经大孔树脂吸附与洗脱后，头孢克洛与杂质可较好地分离开来，其中，大孔树脂表现了疏水、范德华力、络合等作以及经典等方面的作用力，具体的分离原理主要是因为树脂分子的官能团在有效产物与杂质具有不同的吸附和结合能力，故部分不能与树脂结合的杂质将首先被分离掉，之后再采用不同强度洗脱剂来逐将不同结合强度的化合物分离点，最终可达到较好的分离纯化效果。最终产物采用高效液相色谱法进行分析，得到最终产物的纯度超过99.5%，杂志含量在0.5%以下，高于药典要求。

3结论

采用AfPGA催化合成头孢克活，其优化的反应条件为：pH（7.0）；温度（25℃）；缓冲体系（磷酸钠）；酶投入量（3U/mL）；底物浓度（7-ACCA60mmol/L，苯甘氨酸甲酯120mmol/L）。在此条件下底物转化率将达到85%以上，产物纯度可达到95%，杂志含量低于0.5%。

参考文献

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[2]李莉，吴文镶，李志伟.头孢克洛分子烙印聚合物的识别特性[J].河北师范大学学报，2005，29（5）：494-498.

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