纸片法保存临床常见菌种的分析

马芳军杨小玲贾永娟

马芳军杨小玲贾永娟(兰州市第一人民医院检验科甘肃兰州730050)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)26-0234-02

【摘要】目的介绍一种简便易行的菌种保存方法。方法临床分离非苛养菌246株分别用纸片法和半固体琼脂法进行保存，并比较1m、12m、36m两种方法的菌种存活率。结果菌株经保存1m、12m和36m后，纸片法的平均存活率分别为100%、95.1%和88.2%，半固体琼脂法分别为98.0%、76.0%和42.7%。纸片法保存铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌36m后，菌株存活达100%，临床常见菌金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠艾希氏菌、肺炎克雷伯菌保存36m后，菌株存活率均>88%。化脓性链球菌的保存效果不佳。结论纸片法适用于非苛养菌的保存，方法简便易行，不需特殊设备，值得推广应用。

【关键词】纸片菌种保存法菌种存活率简便低成本

1材料和方法

1.1菌株来源

收集2008年1月至10月来自临床病人分离菌株246株，其中金黄色葡萄球菌31株，凝固酶阴性葡萄球菌32株，大肠艾希氏菌61株，肺炎克雷伯菌61株，铜绿假单胞菌31株，白色假丝酵母菌20株，化脓性链球菌10株，培养与鉴定均按全国临床检验规程第三版操作[3]。以大肠艾希氏菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC700603为质控菌株(质控菌株购自甘肃省临检中心)。

1.2实验方法

1.2.1菌种保存：(1)纸片法：用无菌镊子取纸片，以无菌操作，在纸片上刮取复苏后纯培养18h的4-5个菌落，置于灭菌好的1.5ml带盖塑料离心管中，每管1片，盖紧塑料盖并封口，贴上瓶签，分为3组，置-20℃冰箱中保存。(2)半固体琼脂法：用接种针挑取纯培养细菌穿刺接种于半固体培养基，35℃温箱孵育18h后，贴上瓶签，分为3组，置-20℃冰箱中保存。

1.2.2菌种的复活：半固体琼脂法用接种环挑取培养物接种营养琼脂平板，纸片法用灭菌镊子取蘸有菌株的纸片，在营养琼脂平板上轻轻涂抹，以涂菌处为一区，用接种环进行三区划线。所有细菌均置于35℃孵育18h，观察结果，计算两种方法保存1m、12m和36m的存活率。

2结果见表1、表2.

表1纸片法保存不同时间后的菌株存活数

保存时间为1m,两种方法试验数据进行卡方检验P>0.05差异无统计学意义，保存时间为12m,36m两种方法试验数据分别进行卡方检验P<0.05差异有统计学意义

表2纸片法保存后的菌株存活数(株)

3讨论

微生物易变异，为保证在一定时间内微生物不变异且活力强，应将微生物保存在低温、干燥、隔绝空气的环境中[1]。纸片法中滤纸吸水性，使菌体保持干燥，带盖塑料管且封口能隔绝空气，-20℃低温使细菌代谢基本停止，因此，纸片法可达到菌种保存的要求。

保存临床菌株的同时保存标准菌株，本组资料中发现，纸片法中标准菌株保存三年后复活，细菌的菌落特征、生化反应、药敏结果均无明显变化。半固体琼脂法经多次传代培养，细菌的多种特性发生改变，如：金黄色葡萄球菌ATCC25923所产黄色色素变淡，血浆凝固酶变为阴性等。

半固体高琼脂法易干燥导致菌种死亡，还偶见培养基液化引起菌种死亡[2]。本组资料中显示临床分离常见菌大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶阴性葡萄球菌的存活率明显高于半固体琼脂法。由于菌种不同，菌株保存后复活的存活率也不一样，经用临床242株菌分析，结果显示，白色假丝酵母菌、铜绿假单胞菌保存36m后，菌株存活率仍为100%。肺炎克雷伯菌、大肠艾希氏菌、葡萄球菌保存36m后，存活率很高，此结果提示纸片保存法较适用于非苛养菌的保存，对营养要求高的细菌如链球菌等保存后的存活率不理想，这与其他人观察结果相一致[3]，因此，苛养菌不适合用滤纸法进行保存。本组资料还表明，随着保存时间的延长，菌株死亡也在增加，因此，选择最佳保存方法和保存时限是临床工作中的关健[4]。

总之，纸片法保存菌株是一种较新的方法，对临床常见菌的保存效果明显好于半固体琼脂法。纸片法不需特殊仪器设备、成本低、保存空间小、方便携带，值得在基层医疗单位、教学工作中推广应用。

注：文中m为月

参考文献

[1]王娅，金志雄，裴德翠，等.几种简易的菌种保存方法[J]。青岛医药卫生，2009，4(6):451-452.

[2]李笑平，张凯，苏曼玲.菌种保存方法及其优缺点的比较[J].卫生职业教育,2009,27(20)：134-135.

[3]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].北京东南大学出版社，2006：754-869。

[4]黄银欢，钟云，黄润明.2种教学菌种保存方法的比较[J].卫生职业教，2006，24(15):105。