基于毒性评价的甘遂毒性成分的分离

邢瑶马国平

（江苏省中医院江苏南京210001）

【摘要】目的：筛选甘遂的毒性部位，分离、纯化甘遂毒性成分，并进行结构解析，研究甘遂毒性物质基础。方法：95%乙醇回流提取甘遂，回收乙醇后，用石油醚萃取，采用硅胶柱层析法将石油醚部位分成不同极性段，以MTT法测定甘遂各部位对巨噬细胞的增殖抑制作用，确定甘遂石油醚部位中毒性最强的分离段，采用硅胶柱层析法，对毒性极性段进行分离，再结合薄层制备及过凝胶柱SephadexLH-20的方法进一步的分离纯化，获得毒性成分。毒性成分采用MTT法及刺激巨噬细胞释放炎症因子法考察其毒性大小。结果：从甘遂石油醚部位中共分离得到4个化合物，分别为n-tetratriacont-20,23-dienoicacid（1）、Trilinolein（2）、prostratin（3）、β-sitosterol（4），其中化合物3有较强的细胞增殖抑制作用，其IC50为12μM。结论：甘遂的毒性可能与其含有的二萜类成分相关，毒性机制可能与其诱导肠道炎症反应发生相关。

【关键词】甘遂；毒性成分；二萜

【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2018）36-0320-02

甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbiakansui的干燥块根。其性寒味苦，有毒，始载于《神农本草经》，具有泄水逐饮、消肿散结的功效[1]。但其药性峻猛，生用易伤人正气，目前，甘遂的毒性成分及毒性机制尚不明确，文献多报道多集中于其二萜类成分。该类成分属于低极性、小分子类化合物，主要存在于极性较低的石油醚部位，故本研究对甘遂的石油醚部位进行系统分离，通过采用多种细胞毒性评价模型来追踪并分离、纯化甘遂中的毒性成分，并对毒性成分进行结构解析，以期阐明甘遂的毒性物质基础，初步解释其毒性作用机制。

1.实验材料

1.1药材

甘遂采自安徽亳州药材市场，产地河南，药材经江苏省食品药品检验所胡皓彬老师鉴定，为大戟科植物甘遂Euphorbiakansui.的干燥根。

1.2仪器与试剂

德国BrukerDRX-400核磁共振仪；FW80-I高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BOSHYPERSILC18（250mm×4.6mm，5μm）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；UNIQUE-S15型RO-DI实验室纯水系统（锐思捷科学仪器有限公司）。旋转蒸发仪（BUCHRotavaporR-210），HH-2K4二列四孔智能水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司），酶标仪（美国Bio-rad公司），电热板。

柱层析硅胶（100-200目，青岛海洋化工厂分厂，批号：0120367）；薄层层析硅胶（GF254，青岛海洋化工有限公司，批号：0150235）；硅胶板（GF254，青岛海洋化工厂分厂，批号：20160422）；凝胶SephadexLH-20（AmershamBiosciences）；改良型RPMI1640（Thermo，批号：NZM1579）；PBS磷酸盐缓冲液（Thermo，批号：NAC1351）；胎牛血清（WISENT）；二甲基亚砜（南京化学试剂有限公司，批号：1504036200）；青链霉素混合液（无锡海硕生物有限公司，批号：05217862）；所用试剂均为分析纯。

1.3实验动物

ICR小鼠，雄性，体重（20±2）g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物合格证号2010002607085。

2.甘遂毒性成分的提取分离

2.1甘遂不同极性部位的提取

称取甘遂饮片10kg，粉碎成粗粉，以8倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收溶剂，干燥得浸膏867g。取浸膏600g，加水（1:8）混悬后用石油醚萃取，最终得到石油醚部位214.2g，得率3.1%。

取石油醚部位182.3g，湿法装柱200～300目硅胶后，以石油醚-乙酸乙酯洗脱，分为石油醚-乙酸乙酯（15:1）段50.13g、（10:1）段30.1g、（5:1）段28.71g、（1:1）段23.1g、乙酸乙酯段13.2g，以MTT法测定各段对巨噬细胞的增殖抑制作用，筛选毒性部位，结果表1。

2.2化合物毒性评价研究

健康ICR小鼠脱颈椎处死，75%乙醇浸泡消毒3分钟，腹腔注射PBS缓冲液，轻柔地充分按摩腹部，将收集到的腹腔液于1500rpm离心10分钟，沉淀即为富含腹腔巨噬细胞的细胞层。弃去上清，以含10%胎牛血清的RPMI?1640培养液重悬沉淀并调节细胞密度至1*105个/mL，以此密度将细胞接种在96孔板中，每孔100μL，37℃、5%CO2培养2h后，用PBS缓冲液洗三遍，洗去未贴壁的细胞，即为巨噬细胞，采用MTT法评价各极性段的毒性大小。

2.3甘遂毒性化合物的分离、纯化

毒性极性段经过硅胶柱层析后，再采用薄层制备的方法得到较为单一的斑点，最后采用过凝胶柱SephadexLH-20（二氯甲烷-甲醇1:1、甲醇）的方法进行纯化，从石油醚-乙酸乙酯（1:1）段得到化合物1（10mg）、2（23mg）、3（20mg），从石油醚-乙酸乙酯（5:1）段得到化合物4（20mg）。

表1甘遂各极性段对对巨噬细胞增殖抑制作用IC50（μg/ml）值

2.4甘遂毒性成分的结构鉴定

化合物1：无色针状结晶（二氯甲烷-甲醇）：1H-NMR（400MHz，CDCl3）1HNMR（CDCl3）；δ7.29（1H，s），5.41（1H，m），5.37（1H，m），5.32（1H，m），5.12（1H，m），2.78（2H，t，J=7.2Hz），2.44（2H，dd，J=7.2Hz，7.8Hz），2.16（2H，m），2.09（2H，m），1.68（2H，m），1.41（16H，brs），1.32（20H，brs），1.28（8H，brs），1.25（4H，brs），0.87（3H，t，J=7.1Hz，）；13CNMR（CDCl3）：δ178.64（C-1），130.23（C-21），130.03（C-23），128.08（C-20），127.91（C-24），33.88（C-22），31.93（C-21），31.53（C-25），29.68（CH2），29.59（CH2），29.43（CH2），29.35（CH2），29.24（CH2），29.14（CH2），29.07（7×CH2），29.03（6×CH2），27.21（CH2），25.63（CH2），24.68（CH2），24.61（CH2），22.69（CH2），22.57（CH2），14.06（Me-34）。上数据与文献[2]对照一致，故确定为n-tetratriacont-20，23-dienoicacid。

化合物2：黄色油状物（二氯甲烷-甲醇）：13C-NMR（400MHz，CDCl3）δ62.11（glyc-erylCH2），68.09（glycerylCH），173.26（C=Oα），172.84（C=Oβ），31.92（C-2α），34.02（C-2β），24.86（C-3α），24.87（C-3β），29.35（C-4α），29.31（C-4β），29.17（C-5α），29.27（C-5β），29.52（C-6α），29.65（C-6β），29.70（C-7α），29.76（C-7β），29.12（bothC-8），130.00（C-9α），129.98（C-9β），128.05（C-10α），128.07（C-10β），25.62（bothC-11），127.88（C-12α），127.87（C-12β），130.22（bothC-13），27.20（bothC-14），29.36（bothC-15），31.52（bothC-16），22.56（bothC-17），14.06（bothC-18）。上数据与文献[3]对照一致，故确定为Trilinolein。

化合物3：白色粉末（二氯甲烷-甲醇）：1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ：d7.54（s，1H），5.69（d，1H，J=4.8Hz），4.03（d，1H，J=12.6Hz），3.96（d，1H，J=12.5Hz），3.27（brs，1H），3.00（t，1H，J=5.4Hz），2.52（d，1H，J=18.6Hz，），2.46（d，1H，J=18.6Hz，），2.08（dd，1H，J=7.1Hz，14.5Hz，），2.06（s，3H，OCOCH3），1.95～1.99（m，1H），1.77（dd，3H，J=2.3Hz，3.8Hz），1.56（dd，1H，J=11.3Hz，14.6Hz），1.19（s，3H），1.06（s，3H），0.88（d，3H，6.4Hz，），0.84（d，1H，J=5.3Hz，）13CNMR（CDCl3）δ：208.90（C-3），173.30（-COCH3），161.18（C-1），139.87（C-6），132.85（C-2），130.26（C-7），75.98（C-9），73.79（C-4），68.29（C-20），63.63（C-13），55.80（C-10），39.18（C-8），38.69（C-5），36.29（C-11），32.44（C-14），31.83（C-12），23.23（C-15），21.24（-COCH3），18.55（C-18），15.33（C-17），10.10（C-19）。上数据与文献[4]对照一致，故确定为prostratin（酪氨酸激酶抑制剂）。

化合物4：无色针状结晶（石油醚-乙酸乙酯）：13CNMR（DMSO）δ：11.85，11.98，18.78，19.04，19.38，19.79，21.09，23.10，24.30，26.16，28.23，29.21，31.68，31.92，33.98，36.14，36.51，37.27，39.80，42.32，42.34，45.88，50.17，56.10，56.79，71.81，121.69，140.78。上数据与文献[5]对照一致，故确定为β-sitosterol（β-谷甾醇）。

3.小结

腹痛腹泻及严重的胃肠道刺激是误食甘遂临床最常见的中毒症状，研究表明，腹痛腹泻的发病机制有四种[6]：①肠腔内渗透压增加；②肠腔内水和电解质的过度分泌；③肠蠕动加速；④炎症所致的病理渗出物大量渗出。巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，可以通过吞噬及降解被抗体标记过的外来粒子而发挥先天免疫作用。它的激活能够产生细胞因子，这些细胞因子会对肠道粘膜造成破坏，造成腹痛腹泻的反应[2]。

本文从甘遂干燥根的石油醚萃取部位分离得到4个化合物。并测试了其中三种化合物对巨噬细胞的增殖抑制作用，研究发现化合物prostratin具有较强的抑制作用，而化合物prostratin属于二萜类成分，再结合前期的文献研究[3]，本论文认为甘遂致腹泻的毒性作用可能与它的二萜类成分相关。

【参考文献】

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(2010年版一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:195-196.

[2]李玉林.病理学[M].人民卫生出版社,2010.

[3]Evans,FJ,andTaylor,SE.Pro-inflammatory,tumour-promotingandanti-tumourditerpenesoftheplantfamiliesEuphorbiaceaeandThymelaeaceae,In:HerzWed,ProgressintheChemistryof.OrganicNaturalProduct,1983,44.1-99.