七氟醚对内毒素致急性肺损伤犬血清IL-18含量的影响

刘志毅1刘添银1赵为禄1李鑫3汪娟2罗佛全1

刘志毅1刘添银1赵为禄1李鑫3汪娟2罗佛全1

(1南昌大学第一附属医院麻醉科330006)

(2南昌大学医学院麻醉实验室330006)

(3南昌大学医学院麻醉系2008级330006)

【摘要】目的研究七氟醚对内毒素急性肺损伤（ALI）犬血清IL-18含量的影响。方法随机分为四组：急性肺损伤模型组（A组）、机械通气组（B组）、机械通气复合七氟醚治疗组（C组），正常对照组（D组），每组6只。A、B、C组犬经股静脉注射内毒素建立急性肺损伤模型，D组犬用等体积生理盐水代替内毒素。A组在给予内毒素后14h取肺标本行HE染色，观察病理改变，B组在给予内毒素后14h行中等潮气量结合肺开放通气治疗，C组在给予内毒素后14h行中等潮气量结合肺开放通气+吸入七氟醚治疗。B组和C组分别于给内毒素前（T1）、给内毒素后14h(T2)、16h(T3)、18h(T4)和20h(T5)五个时间点，采动脉血5ml，采用ELISA法测定其血清白介素-18（IL-18）的含量。结果注射内毒素后14小时，A组犬肺组织出现炎性损害。B、C两组犬给予内毒素后各时间点血清中IL-18含量明显高于T1(P<O.05)，但两组间各时间点IL-18含量均无明显差异（P>0.05）。B、C两组内，T2、T3、T4和T5各时间点IL-18含量之间无明显差异（P>0.05）。结论静脉注射内毒素可致犬急性肺损伤，IL-18在其中有重要作用，七氟醚对急性肺损伤犬血清IL-18的含量无明显影响。

【关键词】内毒素急性肺损伤七氟醚白介素-18（IL-18）犬

【中图分类号】R614【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）07-0045-02

急性肺损伤（ALI）是全身性炎症反应综合征（SIRS）在肺部的典型表现，病理上主要表现为广泛的肺泡－毛细血管膜损伤，临床后果严重，发病率和死亡率都很高。有研究显示，在美国每年有19.06万例急性肺损伤例，病死率为39.1%[1]。中等潮气量结合肺开放被认为是治疗急性肺损伤的一种可行手段，七氟烷作为一种较新型的吸入麻醉药，在临床中得到广泛使用。在临床使用和动物实验中发现，七氟烷对肺损伤有保护作用[2-3]，但对血清IL-18的影响尚不清楚。本实验拟研究七氟醚对内毒素致急性肺损伤犬血清白介素18含量的影响，旨在探讨在中等潮气量肺开放通气策略的基础上，加用七氟醚吸入对内毒素致急性肺损伤的影响及机制，为其临床应用提供实验依据。

1资料与方法

1.1主要仪器和试剂

呼吸机（simens900c，德国）,压力传感器（益心达，深圳，中国），心电监护仪（Dash4000,通用电气，美国），血气分析仪（Premier3000,GEM,美国），内毒素(050：B5,M4014,Sigma,美国),犬IL-18EILISA试剂盒（上海西唐生物有限公司，中国），七氟醚（喜保福宁，250ml,丸石制药株式会社，日本），氯胺酮，安定，维库溴胺。

1.2动物选择及分组

健康杂种成年雄性犬24只，体质量12.6-14.5Kg，由南昌大学医学院动物科学部提供，按随机数字表法随机分为急性肺损伤模型组（A组）、机械通气组（B组）、机械通气复合七氟醚治疗组（C组），正常对照组（D组），每组6只。

1.3实验方法

1.3.1动物麻醉

实验犬称重后给予氯胺酮(20mg/kg)+地西泮（1mg/kg）肌注麻醉，麻醉后固定犬于手术台上，经口插入6.5＃气管导管，保留自主呼吸。经左侧股动脉插入动脉留置导管，用以采集动脉血标本和行动脉直接测压。经右侧股静脉插人导管，连接微量输液泵，用于静脉给药和输液。氯胺酮微量泵入维持镇静。动物麻醉及操作完毕稳定30min后，记录各参数基础值。

1.3.2ALI犬模型的建立

A、B、C三组犬经股静脉用微量输液泵注入内毒素800ｕg／kg，在10min泵完。D组经股静脉微量输液泵注入等体积生理盐水10min。各组同时监测动脉血气，经股静脉持续输注乳酸林格氏液4ml/kg/h，并根据平MAP、CVP、PAP、PAWP以及尿量予以输液调整。造模成功前自主呼吸空气。

1.3.3动物处理

急性肺损伤模型组（A组）犬处理：给予内毒素14小时后开胸观察活体肺表面大体观，取病变部位组织用4%甲醛固定，然后行石蜡切片,HE染色，在光镜下观察肺病理表现。B组犬处理：注射内毒素14h后行中等潮气量结合肺开放通气策略机械通气，先手法肺开放（手动膨肺，使犬肺峰压至35cmH2O，维持15秒在再呼气，重复3次），之后进行机械通气6小时，Vt=10ml/kg，FiO2100％，f16次／min，I：E=l：2。C组犬处理：模型成功吸入1％VOL的七氟醚,余同B组。D组犬处理：D组在静脉泵持续输注乳酸林格液14h后开胸观察活体肺表面大体观，取病变部位组织用4%甲醛固定，然后行石蜡切片,HE染色，在光镜下观察肺病理表现。

1.3.4标本采集

B组和C组分别于给内毒素前（T1）、给内毒素后14h(T2)、16h(T3)、18h(T4)和20h(T5)五个时间点，抽取动脉血5ml，入促凝管，置4℃冰箱静置4h，取上清液入-70°C保存，用于IL-18的测定。

1.3.5IL-18含量测定

采用ElISA法测定血清中IL-18含量，严格按试剂说明书操作，设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复2对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37°C120分钟。洗板6次，每孔中加入第一抗体工作液100ul，将反应板充分混匀后置37°C60分钟。洗板6次，每孔中加入酶标抗体工作液100ul，将反应板充分混匀后置37°C30分钟。洗板6次，每孔中加入底物工作液100ul，置37°暗反应15分钟，然后每孔加入100ul终止液混匀。用酶标仪在450nm处测吸光值。所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品250、125、62.5、31.2、0pg/ml，为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上左图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-18含量。。

1.4统计学处理

由于IL-18含量原始数据呈非正态分布，故将原始数据经对数转换后，采用SPSS16.0软件(序列号：4106532834)进行统计分析，最后结果以（x-±s）表示。组内比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1内毒素犬急性肺损伤犬模型的建立

D组正常犬肺大体观见肺表面光滑、成淡红色、膨胀均匀（见图1）。病理切片见肺泡分布均匀、肺泡壁完整（见图2）。A组犬在给予内毒素14h后开胸观察，见双肺肿胀，湿润，表面不均，可见散在出血点，部分肺不张或实变（见图3），病理切片可见肺泡间质毛细血管扩张、充血，肺泡及间质内见炎性细胞浸润、大量蛋白浆液渗出、红细胞堆积，可见肺泡壁断裂、肺泡融合或萎陷（见图4）。B（图5、图6）、C（图7、图8）两组犬肺大体观及病理切片与A组犬相似。

2.2血清IL-18含量

B组和C组实验犬血清IL-18含量在给内毒素14h后明显高于给内毒素前，并一直持续至给内毒素后20h（P<0.05），B、C两组间各时间点IL-18含量无明显差异（p>0.05）。机械通气后B、C两组组内各时间点IL-18含量无明显差异(P>0.05)，见表1。

3讨论

ALI是SIRS在肺部的典型表现，其病理特为弥漫性肺泡毛细血管膜损伤、肺水肿和肺不张，是ARDS的早期表现。内毒素是革兰阴性细菌致机体肺损伤的重要成分，常用于复制急性肺损伤模型[4]。本实验研究发现，注射内毒素后14小时犬大体观见肺肿胀、散在出血点，HE染色病理切片见肺泡及间质水肿、炎症细胞浸润、红细胞堆积，并可见肺不张或肺泡萎陷。这些结果此表明，静脉注射内毒素800ｕg／kg后14小时，可诱导犬急性肺损伤，内毒素急性肺损伤犬模型建立成功。

促炎/抗炎介质失衡是内毒素致急性肺损伤的重要发病机制。IL-18是一种重要的促炎因子。革兰氏阴性菌感染时，IL-18与其受体（IL-18R）结合形成异源三聚体，激活炎性信号转导通路，促进炎性介质的释放，抑制抗炎介质的产生，而参与内毒素血症所致急性肺损伤的进展[5]。本实验研究发现，B组犬注射内毒素后14h血清中IL-18含量明显高于注射前，并一直持续至内毒素注射后20h，且肺组织出现典型的病理损害，提示IL-18在内毒素所致急性肺损伤的发生发展中有重要意义。JordanJA等[6]的研究发现，感染动物肺支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-18高度表达并一直持续上升致感染后的24h,气管内给予重组IL-18可使肺血管通透性、BALF中的中性粒细胞数、TNF-α、IL-1β增加，而给予IL-18抗体则出现相反的结果。这进一步表明，IL-18在内毒素致急性肺损伤的发生发展中起着重要作用。

机械通气是治疗急性肺损伤的重要手段，但近来的研究证实，无论大潮气量还是小潮气量通气均存在不足，甚至增加死亡率[7，8]，中等潮气量通气可能更为合适[9]，因此，本实验选择中等潮气量肺开放机械通气策略。七氟醚临床麻醉中广泛应用的较新型吸入麻醉药，既往研究认为其可通过抑制促炎介质的合成，促进抗炎介质的表达而对肺损伤有保护作用[10，11]。但本实验研究发现，C组犬吸入七氟醚后各时间点IL-18含量与B组犬各相应时间点无明显差异，表明七氟醚对内毒素致急性肺损伤犬血清IL-18的含量无明显影响。

综合本实验结果提示，IL-18在内毒素所致犬急性肺损伤中有重要作用，七氟醚对其影响不明显。

参考文献

[1]RubenfeldGD,CaldwellE,PeabodyE,etal.Incidenceandoutcomesofacutelunginjury.NEnglJMed，2005，353(16):1685-1693.

[2]LiuR,IshibeY,UedaM.Isoflurane-sevofluraneadminstrationbeforeischemiaattenuatesischemia-reperfusion-inducedinjuryinisolatedratlungs.Anesthesiology，2000，92(3):833-840.

[3]SteurerM,Schl.pferM,SteurerMetal.Thevolatileanaestheticsevofluraneattenuateslipopolysaccharide-inducedinjuryinalveolarmacrophages.ClinExpImmunol，2009，155(2):224-230.

[4]NumataM,SuzukiS,MiyazawaN,etal.InhibitionofinduciblenitricoxidesynthasepreventsLPS-inducedacutelunginjuryindogs.JImmunol，1998，160(6):3031-3037.

[5]DaiSM,MatsunoH,NakamuraH,etal.Interleukin-18enhancesmonocytetumornecrosisfactoralphaandinterleukin-1betaproductioninducedbydirectcontactwithTlymphocytes:implicationsinrheumatoidarthritis.ArthritisRheum.2004Feb;50(2):432-43.

[6]ArndtPG,FantuzziG,AbrahamE.Expressionofinterleukin-18inthelungafterendotoxemiaorhemorrhage-inducedacutelunginjury.AmJRespirCellMolBiol.2000Jun;22(6):708-13

[7]ordanJA,GuoRF,YunEC,etal.RoleofIL-18inacutelunginflammation.[J]Immunology,2001,167(12):7060-7068.

[8]WilsonMR,ChoudhuryS,GoddardME,Hightidalvolumeupregulatesintrapulmonarycytokinesinaninvivomousemodelofventilator-inducedlunginjury.JApplPhysiol.2003Oct;95(4):1385-93.

[9]GattinoniL.Counterpoint:Islowtidalvolumemechanicalventilationpreferredforallpatientsonventilation?No.Chest.2011Jul;140(1):11-3）

[10]HofstetterC,BoostKA,FlondorMetalAnti-inflammatoryeffectsofsevofluraneandmildhypothermiainendotoxemicrats.[J]ActaAnaesthesiolScand.2007Aug;51(7):893-9.

[11]YueT,RothZ'graggenB,BlumenthalSetal.Postconditioningwithavolatileanaestheticinalveolarepithelialcellsinvitro.EurRespirJ.2008Jan;31(1):11825.

表1两组组各时间点血清IL-18含量(x-±ｓ，n=6)（单位：pg/ml）

＊与组内T1时间点比较，P＜0.05