辅助生殖技术中胚胎冷冻技术的研究进展

王杰周从容

王杰周从容

（贵阳医学院贵州贵阳5500444）

【摘要】人胚胎冷冻保存的原理是先将胚胎放人防冻液中平衡一段时间装管后以一定的冷冻速率迅速降至-35℃，平衡10min后投入液氮中保存，复苏后重新恢复代谢和发育的能力。传统的胚胎冷冻是程序化慢冷冻，实际上是一个脱水过程，随着辅助生殖技术（IVF）周期数的不断增加，程序化慢冷冻也暴露出一些缺点如冷冻过程耗时太长，难以避免冰晶形成对胚胎的损伤等。近年来，随着玻璃化冷冻技术的成熟应用，极大减少了冷冻过程中对胚胎的损伤，复苏率可达95％，因而有更高的着床率和临床妊娠率，胚胎玻璃化冷冻技术在人类胚胎不同时期的广泛应用，能显著改善冷冻复苏效果，提高临床妊娠率。本文就人胚胎冷冻技术的原理、发展过程及对妊娠结局的影响做一综述。

【关键词】胚胎玻璃化冷冻保存辅助生殖技术

【中图分类号】R329.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）28-0287-02

自1978年第一例“试管婴儿”LouiseBrown出生以来，世界上已有超过五百多万例通过辅助生殖技术（ART）出生的婴儿。我国经过30多年的飞速发展，时至今日，无论是药物促排卵方案，取卵过程，实验室的受精条件、胚胎冷冻及移植技术都达到国际先进水平[1]。在IVF周期中我们通常行新鲜胚胎移植时选择相对优质胚胎，将多余胚胎继续培养成囊胚或直接冷冻保存：一方面可以避免浪费胚胎，另一方面以利选择合适的时机移植。对于容易发生卵巢过度刺激综合征(OHSS)，尤其是PCOS的患者，进行全胚胎冷冻，2～3个月后行胚胎解冻移植，可避免OHSS进一步发展损害脏器功能，还可以提高临床妊娠率。

胚胎冷冻保存的原理是将胚胎悬浮在加有或者不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率迅速降至-35℃，平衡10min后投入液氮中保存的过程[2]。此时胚胎的代谢几乎停止或者最大程度的降低，而胚胎在复苏后又能重新恢复代谢和发育的能力。

传统的程序化慢冷冻实际上是一个脱水过程，冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。一旦冰晶形成后其密度变小，体积增大，从而破坏细胞的基本结构，损伤细胞膜。一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤，另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高，造成蛋白质变性即溶液损伤，二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡[3、4]。随着IVF周期数的不断增加，程序化慢冷冻也暴露出一些缺点如冷冻过程耗时太长，难以避免冷冻过程中冰晶形成对胚胎的损伤等。而玻璃化冷冻技术能克服以上的缺点，目前该技术越来越多地运用于临床且取得了良好的妊娠结局。

大量研究表明冷冻胚胎移植是在患者的子宫内膜处于或者接近于自然状态的情况下进行，能有效地提高周期病人的累计妊娠率，降低治疗的总费用和多胎率。玻璃化冷冻技术经过研究者近几年来的探索发展，已经成为胚胎冷冻的主要方法，一方面是因为ART的发展对胚胎冷冻的需求量增大，随着培养条件的改善，使得囊胚培养成了可能，而囊胚移植因其具有能提高临床妊娠率的优势受到了广泛的关注；另一方面由于传统的程序化慢冷冻的结果不甚理想，这与囊胚本身的结构有关。在慢冷冻的过程中冷冻保护剂不能有效的渗透入囊胚腔，使得囊胚腔内的液体容易形成冰晶，影响了冷冻的效果，而玻璃化冷冻能够有效避免冰晶的形成，可以取得更好的效果。Takahashi[5]等报道玻璃化冷冻发生新生儿缺陷的几率是1.4%，这与自然妊娠的人群相仿。由于玻璃化冷冻的大部分载体都是开放性的保存体系，液氮引起的污染担忧也是具有实际意义的，但到目前为止，还没有文献报道由于液氮引起人类疾病传播的案例[6]。实际上即使在-196℃的低温下仍有少量微生物生存，所引起污染的可能也是微乎其微的。况且在临床工作中，对一些病毒携带者的胚胎使用单独的医用液氮罐保存进一步切断了感染的途径。

随着玻璃化冷冻技术的成熟应用，不仅减少了冷冻过程中对胚胎的损伤，复苏率还可达95％[7]，经冷冻复苏后能够继续分裂的胚胎可能有更高的种植潜能，而复苏后不能继续分裂的胚胎可能存在染色体方面的缺陷，在FET时，选择能够继续分裂的、耐受冷冻复苏过程发育潜能好的胚胎移植，可能提高FET后妊娠率[8]。张梦苑等[9]检索大量文献对新鲜胚胎与冷冻胚胎移植在IVF周期中的疗效对比，发现目前大量评价指标提及临床妊娠率、流产率、新生儿出生缺陷、新生儿死亡率及早产率，并进行Meta分析结果提示在IVF周期中冷冻胚胎移植在临床妊娠率方面优于新鲜胚胎移植；在流产率、新生儿出生缺陷、死亡率及早产率方面2组比较差异无显著性意义。目前文献报道大多数冷冻胚胎移的婴儿是健康的[10]，但仍有研究报道与新鲜ICSI子代相比，FET的ICSI子代染色体异常发生率有所增加，值得长期追踪随访[11]。

总之，目前玻璃化冷冻是ART中胚胎卵裂期和囊胚期比较适宜的保存方法。制定“个性化、人性化”的治疗方案，争取得到良好的妊娠结局。

参考文献

[1]ShapiroBS，DaneshmandST，GarnerFC，eta1．Evidenceofimpairedendometrialreceptivityafterovar-ianstimulationforinvitrofertilization：aprospectiverandomizedtrialcomparingfreshAndfrozen-thawedembryotransferinnormalresponders[J]．FertilSteril，2011，96：516—518．

[2]薛庆善.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社,2001:128-136.

[3]孙志宏,马莉,周茂林.人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景.陕西医学杂志,2008,37(2):228-230.

[4]凌秀凤.玻璃化冷冻对小鼠种植前不同发育时期胚胎发育潜能的影响.南京医科大学博士学位论文，2009:16

[5]TakahashiK,MukaidaT,GotoT,OkaC.Perinataloutcomeofblastocysttransferwithvitrificationusingcryoloop:a4-yearfollow-upstudy.FertilSteril2005,84:88一92

[6]UajtaG,NagyZP.Areprogrammablefreezersstillneededintheembryolaboratory.Reviewonvitrification[J]ReprodBiomedOnline,2006,12:779-796

[7]BalabanB，UrrmanB，AtaB，eta1．Arandomizedcontrolledstudyofhumanday3embryocryopreservationbyslowfreezingOrvitrification：vitrifi-cationisassociatedwithhighersurvival，met-abolismandblastocystformation[J]．HumReprod，2008，23：1976—1982．

[8]李力.实用生殖医学[M].人民卫生出版社，2012：209.

[9]张梦苑，陈柯屹等在新鲜胚胎与冷冻胚胎移植在体外受精周期中疗效比较的Meta分析★中国组织工程研究第17卷第53期2013–12–31出版(新疆医科大学第一附属医院妇科生殖助孕中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054).

[10]丁婷综述乔杰辅助生殖与出生缺陷国际生殖健康/计划生育杂志2013年11月第32卷第6期.

[11]BelvaF,HenrietS,VandenAbbeelE,etal.Neonataloutcomeof937childrenbornaftertransferofcryopreseservedembryosobtainedbyICSIanpFandcomparisonwithoutcomedataoffreshICSIanpFcyclesJ.humReprod,2008,23:2227-2238.