细胞因子影响G250抗原在肾癌细胞上表达的研究

武艺

武艺（徐州矿务集团总医院/徐州医学院第二附属医院泌尿外科江苏徐州221006）

【摘要】目的研究细胞因子对G250抗原在肾癌细胞上表达的影响。方法运用免疫组化，Western-Blot和半定量RT-PCR技术对IL-2，IFNα，IFNγ等细胞因子作用肾癌细胞系786-0，OS-RC-2后G250抗原的表达进行检测。结果细胞因子对两种细胞系上G250抗原的表达有上调作用且与浓度及作用时间呈正相关。结论细胞因子在针对G250抗原的肾癌免疫治疗中可以起到重要的作用。

【关键词】G250细胞因子肾癌

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）28-0050-02

肾癌(RCC)是最常见的肾恶性肿瘤，治疗仍以手术为主,放、化疗效果不佳。近十年来，随着对肾癌相关抗原G250研究的深入，针对该抗原的免疫治疗越来越受到重视并被视为治疗肾癌的有效途径。但是肾癌的恶性度越高，G250抗原的表达就越低[1]，针对G250抗原的免疫治疗便难以达到理想的效果。因此，如何提高肾癌特别是高恶性度肾癌G250抗原的表达成为当前的又一新课题。有研究表明，干扰素（IFN）可以上调某些肿瘤相关抗原的表达，为解决这一问题提供了线索。

本研究用IL-2，IFNα，IFNγ等细胞因子作用于肾癌细胞系786-0，OS-RC-2，初步探讨这些药物对G250抗原在肾癌细胞上表达的影响。

1材料与方法

1.1：材料

1.1.1细胞株G250阳性肾癌细胞系786-0，OS-RC-2购自中科院上海细胞研究所，置于含10%FCS的RPMI1640培养基中，37℃，5%CO2温箱培养。取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后备用。

1.1.2试剂G250多克隆抗体购自SantaCruz公司，HRP，AP标记的羊抗兔IgG及DAB显色系统购自北京中衫生物科技有限公司，NBT/BCIP显色系统购自上海吉泰生物科技有限公司。TotalRNAIsolationsystem试剂盒，RTAcesssystem试剂盒购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组取制备好的细胞株786-0，OS-RC-2，分别以2×105/ml密度接种于6孔板中（含10%FCS的RPMI1640培养基）。然后分组如下：1：IL-2组，2：IFNα组，3：IFNγ组（培养基中终浓度为500IU/ml，1000IU/ml，2500IU/ml，5000IU/ml）和4：对照组,37℃，5%CO2温箱培养。培养时间分别为24h,48h,96h。每组设3复孔。

1.2.2G250抗原检测采用免疫组化方法。将1.0×1.0cm的玻片经防脱片处理后置于24孔培养板中。分组后细胞在终止培养前8h用0.25%胰蛋白酶消化，加入已放有玻片的24孔培养板中，每孔接种3×104/ml细胞悬液0.5ml，仍用含有药物的培养基培养。待细胞贴壁后，倒掉培养基，PBS洗涤三遍，4%甲醛固定30min。洗涤，加入G250多克隆抗体，4℃过夜。洗涤，加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃2h，洗涤，DAB显色系统显色。玻片扫描后，计算机分析。

1.2.3G250蛋白检测在免疫组化结果显示的最佳浓度和时间趋势上，采用Western-Blot方法检测细胞株上G250蛋白的表达。实验分组如下：1：IL-2组，2：IFNα组，3：IFNγ组4：IL-2+IFNα组，5：IFNα+IFNγ组，6：IFNγ+IL-2组（培养基中终浓度为5000IU/ml）和7：对照组,培养96h。收集终止培养的细胞，超声破碎，Folin酚法测蛋白，调整蛋白浓度为1.5μg/μl。上样40μl（含60μg总蛋白），电泳后，湿转法将蛋白条带转移至NC膜上。5%脱脂奶粉封闭8h，washing-buffer洗涤三遍，加入G250多克隆抗体，4℃过夜。洗涤，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，37℃2h，洗涤，NBT/BCIP显色系统显色。NC膜扫描后，计算机灰度扫描分析。

1.2.4G250基因检测采用RT-PCR方法。细胞培养及实验分组同Western-Blot方法。细胞总RNA的提取用Promega公司TotalRNAIsolationsystem试剂盒，具体步骤按试剂盒说明书进行。RT及PCR采用一步法，具体步骤按Promega公司的RTAcesssystem试剂盒说明书进行，其中设计G250上下游引物序列如下：上游5’ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCAGGAG3’，下游5’CCACCGCTCGAGTGAAGCGGCCCGCGCAG3’，内参照采用β-actin引物序列如下：上游5’ACACTATACCCATCTACAAAAAA3’，下游5’ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCATGGAT3’。②反应条件：48℃反转录45min，94℃1min变性，60℃30s退火，68℃1min延长，共30个循环；最后68℃7min延长。③取G250，β-actin产物各7μl置同一块1.5%琼脂糖电泳，并在GelDoc1000紫外一次成像仪扫描后，β-actin为内参照，对G250进行半定量分析。

1.3统计学分析States统计软件处理，采用成组设计t检验，P＜0.05有统计学意义。

2结果

2.1G250抗原检测

当IL-2,IFN-α,IFN-γ浓度为500IU/ml时，所有药物在24小时内对两种细胞上G250抗原无上调作用（P>0.05），随着药物浓度的提高，对两种细胞上G250抗原表达的上调作用也逐渐明显（同一时间内，不同浓度组间比较，P<0.05）。随着药物作用时间的延长，对两种细胞上G250抗原表达的上调作用也逐渐明显（同一浓度，不同时间组间比较，P<0.05）。见表1、2。

3讨论

肾癌(RCC)占肾恶性肿瘤的85%以上,目前的治疗仍以手术为主,放、化疗为辅，但效果不佳。随着对肿瘤抗原认识的深入以及抗体技术的发展，针对肿瘤抗原的靶向免疫诊疗成为一种新兴的有前途的方法。近十多年来,在对肾癌肿瘤相关抗原的研究中,发现G250抗原具有良好的肾癌特异性[2]。国外的研究表明,MAbG250对于肾癌具有良好的诊断及治疗的应用潜力,基于G250抗原的肿瘤靶向免疫治疗也取得很大进步[3-4]。

但是，研究人员们也发现，运用MAbG250对肾癌进行靶向免疫治疗时，当抗体浓度增加到一定程度后，疗效便不再随着抗体浓度的增加而有所提高[5]。分析后认为，由于针对G250抗原靶向治疗的疗效与MAbG250和G250抗原结合的量成正相关，当注入体内的G250抗体达到一定数量以后，呈现在肾癌细胞上的G250抗原决定簇都已被靶向结合,出现了饱和现象。因此，增加注射抗体的剂量和浓度并不能提高MAbG250治疗肾癌的疗效。因此，为了进一步提高肾癌特别是高恶性度肾癌靶向免疫治疗的疗效，上调其G250抗原的表达不失为一条有效的途径。

我们的研究发现，IL-2，IFNα，IFNγ等细胞因子对肾癌细胞系786-0，OS-RC-2上G250抗原的表达都有一定的上调作用，且这种作用具有明显的量-效关系和时-效关系。另外，我们还观察到当药物联用时效果的累加现象，具体表现在IL-2+IFNα组，IFNα+IFNγ组，IFNγ+IL-2组细胞上G250抗原的表达比等浓度的IL-2组，IFNα组，IFNγ组细胞上G250抗原的表达明显提高。

综上所述，IL-2，IFNα，IFNγ等细胞因子对肾癌细胞系786-0，OS-RC-2上G250抗原的表达有一定的上调作用，这些药物在基于G250抗原的肾癌免疫治疗中有望成为有力的工具。

参考文献

[1]陈海蛟，叶传忠，张立等.肾癌相关蛋白G250mRNA在肾细胞癌中表达的研究[J].中华泌尿外科杂志,2005;26（7）;440-442.

[2]PotterCPS,HarrisAL.Diagnostic,prognosticandtherapeuticimplicationsoncarbonicanhydrasesincancer[J].BriJCancer,2003;89;2-7.

[3]BleumerI,KnuthA,OosterwijkE,etal.AphaseIitrialofchimericmonoclonalantibodyG250foradvancedrenalcellcarcinomapatients[J].BrJCancer,2004;90;985-990.

[4]SierDF,GeldermanKA,PrinsFA,etal.Beta-glucanenhancedkillingofrenalcellcarcinomamicrometastasesbymonoclonalantibodyG250directedcomplementactivation[J].IntJCancer;2004;109;900-908.

[5]VanDijkJ,UemuraH,BeniersAJetal.TherapeuticeffectsofmonoclonalantibodyG250,interferonsandtumornecrosisfactor,inmicewithrenalcellcarcinomaxenografts[J].IntJCancer,1994;56;262-268.