细菌生化鉴定检验

温凤华

温凤华（黑龙江省双鸭山市宝山区人民医院155100)

【关键词】细菌生化检验

【中图分类号】R12【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）41-0091-01

细菌在新陈代谢过程中进行着各种生物化学反应，由于细菌所具有的酶系不尽相同，对底物的分解能力也不一样，因而其代谢产物也不同。用生物化学方法检测这些代谢产物，可帮助鉴定细菌，这种生化反应测定方法称为细菌的生化试验。在临床细菌检验工作中,除根据细菌的形态与染色及培养特性对细菌进行初步鉴定外，还往往利用细菌的生化试验进行进一步的鉴定，细菌的生化试验对绝大多数分离的未知菌属(或种)的鉴定具有重要作用。因此，掌握细菌生化反应的原理、方法及应用，对于鉴定和鉴别细菌具有重要意义。

细菌的生化试验的基本方法是，将已分离纯化的待检细菌，接种到含有特殊物质和指示剂的鉴别培养基中，通过观察细菌在培养基内的pH值变化，或是否产生某种特殊的代谢产物，来判断细菌的生化反应结果。

1糖(醇、苷)类发酵试验

1.1原理：由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶，故对糖的分解能力及分解糖产生的终末产物各不相同，如有的能分解糖类产酸、产气，有的仅产酸，有的不能分解糖。故可利用此特点以鉴别细菌。

1.2方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到含有指示剂的糖(醇、苷)类发酵培养基中，35℃恒温箱培养18～24h观察结果。若用微量发酵管，或培养时间较长，应注意保持湿度，以免培养基干燥。

1.3结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气.则可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，可使固体培养基内有裂隙等现象。若不分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中除有细菌生长外，无其他变化。

1.4应用：发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

2葡萄糖氧化／发酵试验

2.1原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧需求的不同，将细菌分为氧化型、发酵型和产碱型三类。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论是在有氧环境还是在无氧环境都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。葡萄糖氧化／发酵试验亦称为O／F试验或Hugh－Leifson(HL)试验，利用此试验可区分细菌的代谢类型。

2.2方法：取2支Hugh－Leifson(HL)葡萄糖培养基，置沸水中水浴10min以驱逐培养基中的氧气，冷却后，将待检菌同时接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡(或其他矿物油)，使培养基与空气隔绝。另一支不加液体石蜡，培养基暴露于空气中。将培养基于35℃培养18～24h。

2.3结果：两支培养基均无变化，为产碱型；两支培养基均产酸(变黄)，为发酵型；加液体石蜡的培养基不产酸，不加液体石蜡的培养基产酸，为氧化型。

2.4应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌之间的鉴别。

3伏普试验

3.1原理：伏普试验简称为VP试验。有些细菌在发酵葡萄糖产生丙酮酸后，能使丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基反应，生成红色化合物。试验时，可加入α－荼酚以及含胍基的肌酸或肌酐，以加速反应和增加试验的敏感性。

3.2方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃培养18～24h后，按每1mL培养液加入甲液(50g／L的α－萘酚无水乙醇溶液)0.6mL、乙液(含3g／L肌酸或肌酐的400g／L氢氧化钾溶液)0.2mL。充分振摇试管，观察结果。

3.3结果：呈红色或橙红色反应为.阳性。

3.4应用：VP试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。该试验可与甲基红试验联合使用，甲基红试验阳性的细菌，VP试验通常为阴性。

4β－半乳糖苷酶试验

4.1原理：有的细菌可产生β－半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚β－半乳糖苷(ONPG)而释放黄色的邻硝基酚，故该试验也称ONPG试验。

细菌分解乳糖依靠两种酶的作用：一种是半乳糖苷渗透酶，它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞；另一种为β－半乳糖苷酶，它位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24～48h内发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有β－半乳糖苷酶(胞内酶)，而缺乏半乳糖苷渗透酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，故呈迟缓发酵现象。ONPG结构和乳糖相似，分子较小，可迅速进入细菌细胞，被β－半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚，故由培养基液迅速变黄可测知β－半乳糖苷酶的存在，从而确知该菌为乳糖迟缓发酵菌。

4.2方法：将被检细菌接种到1％乳糖肉汤琼脂培养基上，35℃培养18～24h。用接种环取菌落置于0.25mL生理盐水中制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，37℃水浴5min，使酶释放，然后再加入0.25mLONPG(配制后放4℃冰箱中保存，应为无色，如呈黄色，则不应再用)，混匀后，置于37℃水浴，观察结果。

4.3结果：出现黄色者为阳性(一般在20～30min即显黄色)；3h后仍不出现黄色者为阴性。

4.4应用：本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。

参考文献

[1]何晓青.卫生防疫细菌检验.北京:新华出版社,1989,184.

[2]杜宗敏.生物标志物在微生物鉴定和检测中的应用[J].微生物学免疫学进展;2003年03期

[3]周庭银,赵虎.临床微生物学诊断与图解.上海:上海科技出版社,2001,1977.

[4]食品卫生微生物学检验.GB/T4789-2003.