-80℃条件下不同时间外周血干细胞冻存效果的观察

孙淼项军周明先王苇叶金松刘春华

孙淼项军周明先王苇叶金松刘春华（江苏省靖江市人民医院血液科江苏靖江214500）

【摘要】目的观察外周血干细胞在-80℃条件下保存时间与细胞活性的关系。方法采用一种简便的-80℃干细胞冻存方法，其干细胞保护剂终浓度为5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）,不经程序降温，直接-80℃冰箱冻存，并调整细胞浓度为（2～4）×107/ｍｌ，分别对冻存１、３、６、９、１２月干细胞活性进行检测，观察台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率。结果干细胞活性在１２个月内均无明显下降，其台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率都在８０％以上。不同时间冻存的干细胞活性比较无明显统计学差异（Ｐ＞０.０５）。结论5%DMSO、3%HES和4%HAS作为干细胞冷冻保护剂直接在-80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护外周血干细胞活性。

【关键词】造血干细胞移植外周血干细胞冷冻保存

【中图分类号】R329.2+7【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）24-0059-02

自体造血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效手段之一，但细胞冷冻复苏后的活力是移植成功的关键。如能对细胞进行适当有效地冻存，则细胞活力保持完整，损伤较少，移植后造血功能早期得到重建；反之则相对延迟，甚至失败。以5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）作为干细胞冷冻保护剂直接-80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的干细胞保存方法，该项技术在干细胞移植中已得到广泛应用。我科对7例外周血干细胞移植的进行了22次外周血干细胞的采集，获取的干细胞均采用上述方法冻存，取得了满意的效果。本文对30份同一细胞浓度在-80℃条件下冻存时间对外周血干细胞的保存效果进行实验观察。

1材料与方法

1.1一般资料7例患者中男5例，女2例，年龄23～50岁。非何杰金氏淋巴瘤6例，急性髓细胞性白血病（M2）1例。

1.2干细胞动员与采集所有病例均为自体外周血干细胞移植，动员方案为化疗+G-CSF。化疗方案原则上采用对相应肿瘤有效的联合化疗方案并适当调整剂量。于联合化疗后WBC从谷底开始回升时予以G-CSF(5～10μg/ｋｇ/ｄ，皮下注射)，当白细胞＞4.0×109/ｍｌ，MNC＞10%时开始采集。血细胞分离机为美国血液公司的MCS+。循环血量为2～4倍体循环量，采集3～4次，获得的单个核细胞数范围在（60.3～93.7）×107/ｍｌ。

1.3外周血干细胞冻存

1.3.1冻存保护剂DMSO为上海试剂二厂产品；羟乙基淀粉为德国费森尤斯卡比有限公司生产；人血白蛋白为河南华兰生物有限公司产品。

1.3.2冻存设施-80℃冰箱为日本三洋公司产品；空气净化工作台为苏州苏净集团产品；冻存袋为美国百特公司产品，容量200ml/袋。

1.3.3冻存液5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）[1]。

1.3.4冻存方法提取的干细胞以细胞终浓度（2～4）×107/ｍｌ[2]，小心悬浮于冷冻液中，并加入肝素，分装于低温储存袋中，立即放入-80℃低温冰箱。

1.4指标检测分别于1、3、6、9、12个月快速37～40℃水浴复苏，测其台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率[3]。

2结果

2.1参照推荐干细胞保存细胞终浓度（2～4）×107/ml，我科将采集的细胞终浓度控制在上述范围。

2.2在不同时间点检测外周血干细胞冻存的效果，结果均以均数±标准差（x-±s）表示，t检验求出P值。见表。

表1～12个月-80℃冻存效果

回收率（%）

冻存时间（月）台盼蓝拒染率（%）MNCCD34+细胞

193.23±4.2590.47±3.9493.11±5.62

391.87±3.8488.32±2.9891.48±6.02

687.91±4.1487.52±3.1488.98±6.87

988.15±2.6185.78±3.6187.65±7.04

1282.46±2.9288.12±4.0584.52±6.11

P＞0.05。

由表中可以看出，随着冻存时间的延长，外周血干细胞的台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率呈现逐渐降低趋势，但是与冻存1个月相比无统计学差异。

3讨论

自体造血干细胞移植（PBSCT）已在多种恶性肿瘤的治疗中获得广泛的应用,外周血干细胞保存是PBSCT成功的关键之一，保存干细胞（HSC）的效率高低直接影响移植成功率。HSC的保存分为非冷冻保存和冷冻保存，前者虽无冷冻损伤但保存时间短，限制了临床应用；后者则可以长时间保存，但冷冻过程中会造成细胞损伤，因此如何最大程度的减少HSC在冻存过程中的损伤是需要解决的课题。目前有关HSC冻存的研究重点是：1.如何尽可能降低HSC损伤程度；2.探讨冻存时间与HSC损伤程度之间的关系；3.如何减少冷冻保护液的使用量。1983年Stiff[4]等采用非程序降温法在-80℃冰箱保存骨髓细胞获得成功。国内采用5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）的干细胞保护剂直接-80℃冰箱冻存外周血干细胞获得满意干细胞的回收率的冻存方法亦有报道[5,6]。我科采用此法对对7例移植患者的22例次采集冻存，干细胞回输后全部植活，无1例发生二甲基亚砜中毒现象。

有文献报道，DMSO的毒副作用有高血压或低血压、心律失常、心慌胸闷、腹部不适等，其发生率与DMSO的输入量有关[7]。也有输注DMSO导致过敏性休克的报道。DMSO联合HES是常见的冷冻保护液组成形式，且联合使用在HSC活性保存方面优于DMSO单一使用。长期保存HSC时需要用含50g/l的DMSO的冷冻保护液。目前程序降温与非程序降温均被使用。前者可以提前设定程序，使降温过程标准化，从而保证HSC在冻存过程中不会因降温速度波动而引起细胞质量的变化，最大程度的降低了降温对HSC的损伤。国内沈建良等亦研究证实，利用中短期低温冰箱来冻存造血干细胞是切实可行的。徐长根近期的研究也提示-80℃冰箱中短期冻存脐血干细胞效果良好。

以5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）[1]，形成了非程序降温，-80℃低温冰箱直接冷冻保存人造血干细胞的简化方法。文献曾报道储存最长时间为2年半。国内已有同类报道。我科对30份外周血干细胞在以5%二甲基亚砜（DMSO），3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HAS）作为干细胞冷冻保护剂直接-80℃冰箱冻存。分别观察于1、3、6、9、12个月其台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率，虽然随着冻存时间的延长，外周血干细胞的台盼蓝拒染率和ＭＮＣ、ＣＤ３４＋细胞的回收率呈现逐渐降低趋势，但是与冻存1个月相比无统计学差异，在一年内的回收率基本正常，能满足临床应用的需要。

参考文献

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