耐甲氧西林金葡球菌位点检测的PCR方法构建

鄢育青张子胜邱志强

福建省疾控预防控制中心福州350001

【摘要】目的通过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中VNTR24-01（数目可变串联重复序列）位点多态性检测的PCR方法构建，为后续的MRSA同源性基因分型奠定基础。方法研究梯度变化的dNTP（三磷酸脱氧核苷核苷酸）浓度、梯度变化Mg2+浓度及梯度变化退火温度对PCR产物的影响，建立VNTR24-01位点最优的PCR反应条件及体系，并通过基因测序对该反应进行正确性验证。结果本研究建立的PCR体系最优退火温度为53℃，最优dNTP为160uM，最优Mgcl2为2mM。优化后PCR体系对24株MRSAVNTR24-01有良好的产物检出及多态性分布，并经基因测序证实该体系检出的产物满足实验预期。结论经优化的PCR体系能更好的满足VNTR24-01位点多态性检测的需要。

【关键词】MRSA；VNTR24-01位点；PCR优化体系

本试验寻找最优PCR反应条件及体系是运用到MRSA菌株的多位点串联重复序列（MLVA）分型，相关研究[1]证明金黄色葡萄球菌是重要的致病菌，可以引起各种疾病，包括皮肤软组织感染、伤口感染、菌血症和坏死性肺炎等。为了更好地了解MRSA的群体生物特征及遗传进化关系，有效地进行疫情暴发及溯源分析，多位点串联重复序列分析（MLVA）被广泛使用，而PCR又是其前期基础工作。

影响PCR反应结果的因素有很多，其中包括PCR反应体系中的五要素：引物、dNTP浓度、模板、TaqDNA酶浓度和Mg2+浓度，以及扩增条件中的温度、时间和循环次数。本实验着重研究dNTP浓度、Mg2+浓度和退火温度，寻找最优PCR反应条件及体系。

1.材料与方法

1.1菌株来源：

收集福建省疾控中心和昆明市第一人民医院检验科2016年5月-2017年10月临床分离鉴定的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌24株。

1.2预实验常规PCR扩增体系：

反应总体积为50ul，10xTaq酶缓冲液，5ul；dNTP混合物，2mMeach，5ul；正向引物，1ul；反向引物，1ul；20mMMgCl2，4ul；DNA模板，2ul；TaqDNA聚合酶，1.25ul；无核酸酶水补足30.75ul。PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸45sec；72℃后延伸10min。

1.3琼胶糖凝胶电泳

运用凝胶成像分析系统GelDoc2000tm进行拍照分析。

1.4优化PCR扩增体系：

研究梯度变化的dNTP浓度、梯度变化Mg2+浓度及梯度变化退火温度对PCR产物的影响，建立最优PCR反应条件及体系。

1.5对VNTR

24-01位点PCR检测方法进行测序验证，所得序列进行核心序列重复次数分析，其结果与PCR扩增产物电泳分析结果完全一致。

2.实验结果

2.1最适退火温度，如图1

1最适退火温度53℃

VNTR24-01位点退火温度梯度（55/54.6/54/53/51.7/50.9/50.3/50℃）

2.2最适合的Mg2+浓度，如图2