甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色法在显示乳腺组织凋亡细胞中的应用

邹阳强

邹阳强（贵州航天医院病理科贵州遵义563000）

【中图分类号】R655.8【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）7-0193-02

【关键词】组合染色乳腺组织凋亡细胞

凋亡细胞的检测有苏木精—伊红染色、特殊染色、原位末端标记法、免疫组织化学、琼脂糖凝胶电流、ELISA检测法、电镜、FCM检测法等方法，众多研究方法各具特点，也有其局限性[1]。形态学检测是凋亡细胞一种较常用、较直观的检测方法，为了提高凋亡细胞的染色效果，本实验利用甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色显示乳腺组织中凋亡细胞获得满意结果，为乳腺组织凋亡细胞的研究提供一种较好的形态学研究方法。现介绍如下。

1材料和方法

1.1材料收集贵州航天医院病理科2011年01月至2011年10月临床手术切除送检的乳腺标本30例，其中乳腺增生症10例，乳腺纤维腺瘤10例，乳腺癌10例。4%中性甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。

1.2试剂配制2%甲基绿水溶液：甲基绿1g，蒸馏水50ml，充分溶解后取2%甲基绿水溶液20ml，置分液漏斗中，再加入20ml三氯甲烷摇荡3min，静置10min可见甲基绿和三氯甲烷分成两层，打开活塞放掉比重高的三氯甲烷，经多次反复洗除后至三氯甲烷无色即可得改造后的甲基绿，置冰箱内保存[2]。派洛宁染色液：派洛宁2.5g，蒸馏水100ml，充分溶解。马休黄染色液：马休黄0.5g，95%乙醇100ml，磷钨酸0.2g，充分溶解待饱和后使用。应用染色液：改造后的甲基绿10ml，派洛宁染色液5ml，丙三醇15ml，0.2M醋酸缓冲液（pH4.8）20ml。

1.3染色程序①石蜡切片4μm，常规脱蜡至水洗。②0.2M醋酸缓冲液2min。③应用染色液20min。④0.2M醋酸缓冲液洗2次。⑤马休黄染色液染30s。⑥直接用丙酮洗2次。⑦二甲苯透明、中性树胶封固。

2结果

凋亡细胞中细胞核DNA呈绿色，但核固缩，细胞质RNA呈红色，散在或成群分布，背景呈淡黄色（图1）。

图1：凋亡细胞核中的DNA呈绿色，细胞质中的RNA呈红色，背景呈淡黄色。（甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色×200）

3讨论

凋亡是活体内个别细胞程序性死亡的表现形式，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动的、生理性死亡[3]。在形态上凋亡细胞表现出一定的特征性，这使得是细凋亡细胞与另一种常见的细胞死亡方式细胞坏死有着本质的区别。凋亡细胞皱缩及变形，细胞质浓缩，核染色质边集、浓缩，细胞核碎裂，形成凋亡小体。在用常规HE染色进行形态学研究时，少数典型的凋亡细胞可直接观察，但多数凋亡细胞因不醒目而容易被忽略，特别是凋亡小体体积很小，就更不易引起人们的注意。随着病理技术的发展，免疫组织化学、原位杂交等技术越来越普及，以及各种检测试剂盒的问世，可采用多样化的方法，来检测和研究细胞凋亡，但一些特殊染色技术仍然是病理学研究中必不可少的技术。在形态学研究细胞凋亡中，还应该将HE染色作为重要的基础，同时寻找理想的简易且特异性较强的染色方法来证明凋亡细胞，以提高形态学的实际应用效果。

甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色机制是细胞核中带负电荷的DNA和带正荷的甲基绿极性吸附而使细胞核着色，细胞质中带正电荷的RNA对带负电荷的派洛宁有一定的亲和力而使细胞质着色。甲基绿和派洛宁在水中电离后都产生带电荷的离子，当两种染色液混合后，甲基绿电离后产生正电荷多，其碱性较强，能够与DNA极性吸附，而派洛宁电离后碱性较弱与RNA吸附结合，两者是通过竞争而产生不同的着色效果。甲基绿对DNA染色的特异性和派洛宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的DNA着色，若细胞质内RNA呈派洛宁染色（红色）者为凋亡细胞[4]；马休黄则能对凋亡细胞中的DNA和RNA有较强的增色作用，对其他组织成分具有退行性[5]，使结果更鲜艳，对比更明显，大大提高了凋亡细胞的检出率。

甲基绿是一种生物染色剂，是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末，溶于水，显蓝绿色；甲基绿是用氯和碘代甲烷与甲基紫作用的化合物，因此甲基绿中含有甲基紫。甲基紫又称龙胆紫或结晶紫，是副品红的四、五、六甲基衍生物的混合物，可作为细胞核的染料呈紫篮色。在实验中必须将甲基绿中的甲基紫去除，否则甲基紫也会使细胞核着色呈紫蓝色，这与甲基绿和细胞核中的DNA结合成的绿色相混，不利于观察。可利用甲基紫溶于三氯甲烷的特点来改造甲基绿，甲基紫溶于三氯甲烷而呈紫红色，甲基绿则不溶于三氯甲烷，经过反复去除甲基紫至三氯甲烷无色后才能保证甲基绿的纯度，方可作为DNA着色较好的染色剂。

总之，作者认为本实验方法能很好地显示细胞核中的DNA和细胞质中的RNA，色彩鲜艳且对比明显，检出率较高，是研究乳腺组织细胞凋亡的一种较好的形态学方法。