左旋精氨酸在血管旁路移植术中对静脉移植物保护作用的实验研究

孟春营1郭则蘅2赵萍1温定国1罗滨1

孟春营1郭则蘅2赵萍1温定国1罗滨1

（1暨南大学附属第二临床医学院/深圳市人民医院心外科广东深圳518020)

(2深圳市福田区妇幼保健院儿保科广东深圳518000）

【摘要】目的观察左旋精氨酸(L-Arg)对自体移植静脉内膜增生的影响,探讨其作用机制。方法60只新西兰兔,随机分为左旋精氨酸实验组、生理盐水对照组。术前3d开始采用灌胃法给予辛伐他汀(10mg/Kg溶于10ml生理盐水),经耳缘静脉给予左旋精氨酸(100mg/kg),对照组给与等量生理盐水,每天一次,直至术后取材。所有动物术日建立自体静脉旁路移植模型:于术后1、2、4、6周及8周取材。观测新生内膜与中膜面积比(IPM)、细胞间黏附分子(ICAM21)及细胞周期素A(CyclinA)的表达,统计学分析各组间差异。结果移植4周后,各组静脉均有内膜及中膜较正常颈静脉明显增厚表现,左旋精氨酸组内膜及中膜增厚较对照组轻。两组静脉桥的管腔狭窄程度进行比较存在明显差异。结论(1)兔静脉移植至股动脉后内膜及中膜增厚。(2)左旋精氨酸联合降脂药物能抑制移植静脉内膜及中膜增生,减少静脉桥狭窄。

【关键词】左旋精氨酸静脉移植细胞增殖

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）19-0055-02

冠状动脉旁路移植术(coronaryarterybypassgrafting,CABG)已成为治疗冠心病的重要手段之一,治疗冠心病使我们面对越来越多的静脉动脉化的问题。目前自体静脉仍是主要的血管桥移植来源,研究发现“静脉桥”随时间的推移可发生退化、进行性狭窄、血栓形成,并最终发生闭塞，有报道表明5年通畅率仅为50%～70%。故术后如何保持移植血管的通畅率是临床上亟待解决的问题。鉴于此,本实验通过建立兔自体移植静脉模型,旨在观察L-Arg对移植静脉内膜增生的影响,并分析其可能的机制。为临床预防自体移植静脉再狭窄提供一新的思路和方法。

1资料与方法

1.1试验对象

健康新西兰大白兔60只,体重2.6±0.2kg(由中山大学实验动物中心提供),随机分成两组:左旋精氨酸联合辛伐他汀实验组及生理盐水对照组,每组30只。并设定自身对侧未移植颈外静脉作为正常静脉参照。生理盐水对照组:术前三日始,经胃灌注生理盐水10ml,每日一次,直至术后取材。实验组:术前三日始,经胃灌注含辛伐他汀生理盐水(10ml+辛伐他汀10mg/kg),经耳缘静脉给予左旋精氨酸(100mg/kg)每日一次,直至术后取材。

1.2颈外静脉移植至股动脉的动物模型的建立[1]

术前禁食水4小时。耳缘静脉内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。麻醉成功后全身肝素化(3mg/kg耳缘静脉注射)。碘伏消毒皮肤,取股内侧纵切口,长约5cm,切开皮肤及皮下结缔组织,在前后肌群间隙内分离股动静脉,游离股动脉长约2～3cm。在动脉下面引过1根丝线备用。取颈正中切口,长约5cm,在胸锁乳突肌外缘寻找到颈外静脉,沿血管走行方向将颈外静脉轻轻分离,上至上颌外静脉与上颌内静脉分叉处,下至胸骨水平,游离颈外静脉。取其主干约4.0cm,两端予以结扎。离断所取静脉段,留取0.5cm作为正常静脉参照,用生理盐水(含肝素5000U/L)冲洗管腔,并置于同样液体中常温保存。股动脉远近两端置无创血管夹(哈巴狗),用冠脉刀分别于动脉两端前壁剪开约2.5mm,相距约2.0cm。2.5倍手术放大镜下修剪静脉两断端,分别与剪开之动脉壁用7-0Prolene线连续作端侧吻合。先吻合近端,后吻合远端,吻合完毕后,开放近心端动脉夹,从未打结的远端吻合口排气及冲出血凝块,打结完毕后开放远端动脉夹。然后结扎两吻合口之间股动脉。吻合后静脉桥充盈明显,触之可有动脉搏动。术后处理:常规普通饲料饲养,手术当天开始,每日阿司匹林5mg/kg混入饲料抗凝,肌肉注射青霉素(30ku/kg)预防感染,连续3天。

1.3标本的采集

分别于移植后1、2、4、6周及8周采用相同方法麻醉,沿原切口分离、检查移植静脉是否通畅,切取移植血管,分成两段,一段置于用4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋待检,备光镜检查;另一段静脉沿管腔纵形切开,生理盐水洗净置于5%的戍二醛固定20h后放入75%的酒精中保存。

1.4组织学观察

标本常规脱水,透明浸蜡包埋,制成5μm厚的石蜡切片,常规脱蜡脱水,HE及弹力纤维VG染色,光镜观察。计算机图像分析仪分析血管新生内膜面积和中膜面积。以新生内膜面积P中膜面积(IPM)的比率表示血管内膜增生程度。

1.5免疫组织化学检查

细胞间黏附分子(ICAM-1)抗体为SantaCruz公司产品(单克隆抗体,工作浓度1∶100),细胞周期素A(CyclinA)抗体为Sigma公司产品(兔多克隆抗体,工作浓度1∶100)。均采用SP法免疫组化染色,DAB显色,正常静脉作自身对照,PBS代替一抗作阴性对照。光镜下观察(×400),ICAM-1阳性表达为细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒,CyclinA阳性表达为细胞核内可见棕黄色颗粒,胞浆轻度黄染,计数单位视野内阳性表达占总细胞数百分比。

1.6统计学方法

采用SPSS-2.0统计分析软件处理数据。计量资料以均数加减标准差表示,两组间比较用t检验,多组间比较用方差分析,相关分析采用直线回归。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1病理变化:移植4周后的各组血管的内膜中膜厚度分别为:正常组(51.15±2.64)、实验组组(74.020±2.15)、对照组(98.54±4.34),各组之间P=0.000,均小于0.05,有统计学意义(见表1)。

表1动脉化静脉血管厚度变化(x-±s)

注:与正常组比较,3P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

2.2扫描电镜形态学观察

术后1周,内皮细胞(EC)基本完全脱落,平滑肌细胞(VSMC)开始增殖并向内膜迁移,血管壁内可见大量炎性细胞浸润,内膜无明显增厚。术后2周,EC覆盖部分内膜,大量VSMC移行进入内膜,内膜开始增厚。术后4周,EC基本完全修复,但仍未达到完整,内膜下大量VSMC增殖,细胞外基质分泌明显增多。术后6周,内膜增厚达高峰,VSMC数量最多,细胞外基质沉积严重。术后8周,VSMC数量减少,细胞外基质进一步增多。术后1周L-Arg组残留EC数量增多,管壁单核细胞浸润减少。术后2周,L-Arg组EC修复较对照组明显。术后4、6、8周,与对照组相比较,新生内膜厚度变薄,VSMC数量减少,细胞外基质沉积减轻。

2.3新生内膜面积、厚度测定、新生内膜面积与中膜面积比

正常颈静脉:内膜仅是单层内皮细胞覆盖,中膜很薄,由2～3层平滑肌细胞及胶原组成。术后4周,实验组和对照组静脉桥均可见血管内膜受损,局部有附壁血栓,并可见薄层新生内膜形成。对照组内膜增生更为明显。实验组内膜于移植术后增厚,但与对照组比较,内膜增生受到明显抑制,新生内膜厚度及面积与对照组相比差异均有显著性(P<0.05和P<0.01)。见表2。

表2两组移植静脉不同时间点新生内膜厚度及面积的变化(x-±s)

注:与对照组同期相比3P<0.05。

静脉移植术后1周,对照组静脉内膜开始增厚,且随时间延长而逐渐增厚,6周时内膜增厚达峰值。术后2、4、6周及8周L-Arg组IPM与对照组相比较,差异有显著意义(P<0.01),术后1周L-Arg组与对照组比较差别无显著意义。

3讨论

自体移植静脉在冠状动脉旁路术中广泛应用,但由于静脉生理功能和结构与动脉存在差异,静脉移植于动脉系统后在动脉压力和动脉流体力学环境下往往出现内膜过度增厚,影响远期通畅率。移植后血管桥再狭窄问题亟待解决。有报道[2]术后1年移植静脉血管堵塞发生率为15%,10年后上升至50%。早期的血栓形成、内膜增生以及后期的粥样硬化被认为是静脉桥狭窄的主要原因,内膜增生被认为移植静脉再狭窄病变的关键环节[3],而通过调整血管壁平滑肌细胞增殖与凋亡的动态平衡可以有效控制内膜增生[4],因此抑制平滑肌细胞过度增生、诱导平滑肌细胞凋亡,一直是防治移植静脉再狭窄努力的方向[5]。

观察不同时间段血管桥病理切片,见术后1周静脉桥血管壁增厚,内膜及中膜均明显增厚,中膜弹性纤维增多;术后2～4周内膜增厚达高峰,且不均匀,中膜、内膜均有增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达。内膜出现α-actin阳性细胞表达,说明中膜平滑肌细胞增生、迁移至内膜,参与新内膜形成,使内膜增厚。此期血管内膜结构疏松,可能是平滑肌细胞表型转变为分泌型,分泌大量细胞外基质;术后4周增生内膜中可见大量泡沫细胞,这可能是晚期形成血管粥样硬化的潜在因素。术后8周血管内膜结构致密,中膜弹性纤维明显增多,排列整齐。另外术后1周中膜和新生内膜可见少量凋亡细胞,术后4周凋亡细胞增逐步达到高峰[6]。移植后静脉壁重构过程是为了适应动脉血流动力学环境,是在多细胞因子作用以及基因控制性表达等多途径反馈机制调节下进行。

血管内膜增生的过程有三个高峰:(1)血管平滑肌细胞在中膜增生。内皮细胞损伤后即诱发血栓形成,在血栓形成的24h内血管平滑肌细胞即开始增生。(2)血管平滑肌细胞由中膜迁移至内膜。血管损伤后释放酶类降解胞外基质,血管平滑肌细胞于血管损伤后第4天即开始由中膜向内膜游移,持续4周。最近有研究显示外膜的成肌纤维细胞也能增生并向内膜游移[7]。(3)内膜显著增厚,血管平滑肌细胞增殖、游移以及大量胞外基质的合成使内膜迅速增厚。转型生长因子-β(TGF-β)和血小板源性生长因子(PDGF)等可刺激血管平滑肌细胞产生胞外基质。刺激血管平滑肌细胞增殖的因子亦可使其合成胞外基质。血管平滑肌细胞的异常增殖是血管移植术后新生内膜形成和发展的重要致病机制之一。对平滑肌细胞增殖的分子生物学研究越来越引起人们的重视。CyclinA及细胞周期素依赖性激酶(CDK)抑制蛋白是调控VSMC增殖周期的重要因素,它们作用于细胞周期的不同时相,引发或抑制细胞的分裂增殖,加速或延续细胞周期的进程。CyclinA具有重要的促进VSMC增殖的作用,在DNA合成期(S)与CDK2结合,是S期顺利进行启动DNA复制所必须的因子,同时对DNA合成前期(G1)PDNA合成期(S)交界区也有调节作用。NO供体可以抑制VSMC增殖,其作用机制是复杂的也是多方面的,NO抑制CyclinA的表达进而促进细胞增殖停滞于G1PS期是重要的机制之一。Guo等[8]报道在培养的VSMC中加入NO供体亚硝基氰化钠(SNP),CDK2表达未受影响,但可阻断CyclinAmRNA及蛋白的表达,VSMC则出现增生抑制现象。本研究中L-Arg组移植静脉VSMC增殖程度及CyclinA的表达水平均显著低于对照组,说明在动物体内NO供体也可以起到调节平滑肌细胞增殖的作用。

近来研究发现左旋精氨酸有改善心、脑、肺、胰等组织缺血再灌注超微结构损伤的作用。推测与下列因素有关(1)在缺血再灌注时扩张血管,减少炎性递质释放,减少再灌注损伤,改善局部血流,平衡氧和能量代谢。(2)L-精氨酸为NO合成的前体物质,NO作为重要的信使分子和效应分子,具有多种生物学效应,不仅对血管有强效扩张作用,还抑制血管内皮和血管壁平滑肌细胞的增殖与移行,有利于改善血管的重构,同时抑制血小板的聚集和中性粒细胞的粘附,对减少血管阻力,维持血管畅通起着关键性的作用。根据其作用机制对移植桥静脉内膜增生有抑制作用,减少进行性狭窄和血栓形成,对移植静脉的预后发挥重要作用。本实验采用兔颈外静脉作为桥血管端-侧吻合于股动脉制备静脉动脉化模型,在围手术期应用上述两种药物干预,与对照组相比,统计学处理有显著差异,说明能减轻术后移植血管的缺血再灌注损伤、抑制血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和移行,抑制血小板的聚集和中性粒细胞的粘附,对减少血管阻力、维持血管通畅起着关键性的作用。本实验为提高自体移植静脉的通畅率提供了一定的临床依据。因此,应用NO供体预防移植静脉再狭窄可能是一个新的有前途的方法。

参考文献

[1]杨德勇等.辛伐他汀联合左旋精氨酸对自体移植静脉保护作用的实验研究[J].泰山医学院学报,2011(2):416-419.

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基金项目:广东省自然科学基金资助项目编号:9151802001000011。