冬凌草甲素可逆共价分子印迹聚合物的制备及其性能研究

黄少梅1张亚楠2杨万里3何建峰3

（1佛山市第三人民医院广东佛山528041）

（2广州康盛生物科技有限公司广东广州510663）

（3广州中医药大学广东广州510006）

【摘要】以冬凌草甲素为印迹分子，4-乙烯苯硼酸为功能单体，采用二乙烯基苯（DVB）为交联剂，通过本体聚合制备了冬凌草甲素可逆共价印迹聚合物。研究表明聚合物平衡吸附量达到74.42μmol·g-1，具有吸附速度快且特异识别能力。

【关键词】冬凌草甲素；顺式二醇；分子印迹；可逆共价；固相萃取

【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）04-0121-02

冬凌草甲素是冬凌草中抗癌效果最强的成分，且副作用小，它在癌症方面的治疗作用[1]已经引起人们的高度重视。分子印迹技术是一种制备对模板分子具有高度识别能力聚合物的技术。制备过程简单，制备的聚合物性质稳定，因此在药物分离，固相萃取，生物传感器等领域具有广泛的应用[2]。本研究用冬凌草甲素作为模板分子，4-乙烯基苯硼酸为功能单体，采用可逆共价结合方式制备对冬凌草甲素具有高度识别能力的分子印迹聚合物。

1.试剂及仪器

冬凌草甲素（Oridonin，规格98%，泽朗植提）；4-乙烯基苯硼酸（规格80%，天津阿法埃莎化学有限公司）；二乙烯基苯（DVB，AR，上海阿拉丁试剂有限公司，使用前减压蒸馏）；其他试剂均为AR。

2.实验部分

2.1冬凌草甲素共价印迹聚合物的的制备

称取0.0365g（0.1mmol）冬凌草甲素模板分子，0.0140g（0.1mmol）功能单体4-乙烯基苯硼酸，溶于30mL1，4-二氧六烷（H2SO4作为催化剂）于88℃下搅拌回流1h，5000rpm-1离心30分钟，用少量甲醇洗后干燥得预聚体。将预聚体溶液转入到试管中，依次加入0.746g(5.73mmol)DVB或0.547g(2.76mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，0.01g0.06mmol)偶氮二异丁腈（AIBN）及2.0mL的1，4-二氧六烷，然后通氮10min，密封后置于65℃水浴中恒温反应36h。反应得到白色块状聚合物，将聚合物研磨并过120目筛，得聚合物微粒。用甲醇-盐酸(pH=3)(v/v，7:3)洗脱，直至抽提液经紫外检测无模板分子吸收为止。得到的分子印迹聚合物（MIP）在65℃下真空干燥24h，备用。

空白聚合物NIP的制备方法同上，但不加模板分子。

2.2分子印迹聚合物的性能研究

2.2.1动力学吸附研究准确称取六份10mgMIP置于10mL磨口锥形瓶中，分别加入2mL2mmol·L-1冬凌草甲素的甲醇-磷酸缓冲液（pH=7.40）(v/v，7:3)标准溶液，置于磁力搅拌器中搅拌，分别于5min、15min、30min、1h、3h、5h收集样品，用0.22μm微孔滤膜过滤，经紫外光度法检测滤液中待测物的浓度，计算出聚合物在各时间点对模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

2.2.2聚合物的底物选择性研究准确称取五份10mgMIP和NIP分别置于10mL磨口锥形瓶中，分别加入2mL2mmol·L-1冬凌草甲素、5-氟尿嘧啶、氯霉素、苯基-1，2-乙二醇、茶碱的甲醇-磷酸缓冲液（pH=7.40）(v/v，7:3)标准溶液，室温下搅拌24h，用0.22μm微孔滤膜过滤，经紫检测滤液中待测物的浓度，计算出聚合物对模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

3.结果与讨论

3.1MIP洗脱条件探讨

聚合物中冬凌草甲素和功能单体是以可逆共价键的方式结合的，性质较稳定。经过查阅相关文献发现，甲醇-水溶液和pH=3.0的盐酸对酯键的水解具有促进作用，因此对洗脱条件进行以下探讨：首先，采用甲醇-盐酸（pH=3.0）(v/v，1:1)在常温下搅拌洗脱24h，通过紫外分光光度计检测发现洗脱率较低。随后将聚合物于60℃搅拌回流，洗脱率明显增加，结合冬凌草甲素在水中的溶解度较低，研究最后采用甲醇-盐酸缓冲液（pH=3.00）(v/v，7:3)为洗脱剂，于60℃搅拌回流，其洗脱率最高。

3.2MIP结构表征

MIP（洗脱前）IR数据（3438.56，1723.30，1141.64，1071.06，989.04cm-1）；MIP（洗脱后）IR数据（3441.30，1138.18，1068.77，992.33cm-1）。对照两者红外光谱数据发现，未洗脱的MIP存在一个羰基峰（1723.30cm-1），即模板分子冬凌草甲素的羰基峰，洗脱干净的MIP的红外光谱图上未出现冬凌草甲素羰基峰。结果显示，MIP中的模板分子被完全洗脱液彻底去除。此外，空白聚合物的红外光谱图，NIP：IR（3437，1152.06，1075.25，989.10cm-1），由于空白聚合物与洗脱后MIP结构组分相同，而两者的红外光谱图其主要特征峰基本保持一致。

3.3MIP吸附性能评价

3.3.1动力学吸附动力学实验结果表明，MIP的吸附在5h后已逐渐趋向平衡，共吸附74.1μmol·g-1，其中，5min可达到平衡吸附量的15.3%（11.31μmol·g-1），15min可达到平衡吸附量的39.6%（29.34μmol·g-1）。

3.3.2选择性吸附聚合物对底物的结合分配系数科描述为Kd=CP/CS，式中CP（μmol/g）为底物在聚合物上的结合量；CS(mmol·L-1)为平衡吸液中底物的浓度。分离因子α描述为α=Kdi/Kdj，式中Kdi/Kdj分别为模板与结构类似物的结合分配系数。Kd值越高，表示聚合物对该底物的结合量越大；ɑ值越高，表示聚合物对底物的选择性越好。

硼酸基团对1，2-顺式二醇比其他醇类选择性更强。根据这一理论特点，我们分别选取具有1，3-二醇化合物氯霉素、5-氟尿嘧啶，1，2-邻二醇基团的化合物苯基-1，2-乙二醇和冬凌草甲素作为聚合物的底物，对其选择性进行探讨。见表。

表1聚合物对不同底物的选择性

聚合物：10mg；底物浓度：2mmol·L-1；底物用量=2mL；吸附溶剂：甲醇-磷酸缓冲液（pH=7.40）(V/V，7:3)；吸附时间：24小时；吸附温度25℃。

从表可看出，MIP对冬凌草甲素的吸附能力优于其他三种底物，表现出较好的选择性。其中5-氟尿嘧啶空间结构较小，较易进入MIP孔穴结构中，Kd值较大。MIP与冬凌草甲素官能团互补的功能基团，再加上与其立体结构相互补的特定形状的孔穴，使得MIP对冬凌草甲素显示出特效的选择结合特性。NIP数据中显示，NIP对1-苯基-1，2-乙二醇也有较强的结合能力，这是由于冬凌草甲素与1-苯基-1，2-乙二醇都具有邻二醇结构，在NIP表面与4-乙烯基苯硼酸的结合能力基本相同，但不具有孔穴结构的记忆选择性。据此，我们可以推测是模板分子冬凌草甲素的顺式邻二醇基团与功能单体4-乙烯基苯硼酸的硼酸基团相互作用，并最终在聚合物的孔穴中产生了识别位点。

4.结论

本研究第一次以4-乙烯基苯基硼酸作为功能性单体，二乙烯基苯作为交联剂制备出冬凌草甲素的共价分子印迹聚合物。在吸附实验中采用可逆共价特异性结合的冬凌草甲素分子印迹聚合物不仅显示出较快的吸附动力学速率和专一识别性能，且较利用分子间氢键结合的印迹聚合物[3]有更高的吸附量。这项研究也为具有顺式二醇结构的中药活性成分分离纯化提供了重要参考。

【参考文献】

[1]于洋，王小芳，许泽平，等.冬凌草甲素抗乳腺癌作用的研究进展[J].世界肿瘤研究，2017(2)：63-67.

[2]柯珍，朱华，钟世安，等.分子印迹技术及其应用研究进展[J].化学研究与应用，2018，30(6):865-874.

[3]谢珍茗，何建峰，余林，等.冬凌草甲素分子印迹聚合物的制备及分子识别性能研究[J].化学研究与应用，2011，23(10):1349-1352.

[4]LideDR.CRChandbookofchemistryandphysics[M].BocaRaton:CRCPress，1994:9.