土贝母冷浸液体外对HBsAg、HBeAg的抑制作用研究

周艳萌1向晓波2

（1遵义医学院微生物与免疫学实验室贵州遵义563000）

（2遵义医学院附属口腔医院口腔外科贵州遵义563000）

【摘要】目的：探讨土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞的毒性及其分泌的HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法：采用MTT比色法观察受试药物对细胞的毒性，运用酶联免疫吸附(ELISA)试验检测药物对细胞分泌的HBsAg和HBeAg的影响。结果：土贝母冷浸液低于32?g/mL浓度对细胞无明显毒性作用。16?g/mL和8?g/mL的土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg均有抑制作用，对HBeAg的作用强于对HBsAg的作用，抑制作用在2d时效果最好且抑制率高于阳性药物对照拉米夫定组，但随着用药时间的延长抑制作用反而减弱。结论：土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg具有抑制作用。

【关键词】乙型肝炎病毒；HepG22.2.15细胞；土贝母

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）25-0066-02

乙型肝炎病毒（HBV）是一种严重威胁人类健康和生活的嗜肝DNA病毒，据WHO报道，全世界约有1/3的人被HBV感染[1]，而慢性乙肝患者全球约有2.4亿人，目前，已经批准用于治疗慢性乙肝的药物主要有两大类：核苷（酸）类似物（如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等）和干扰素类药物[2]。但是西药治疗乙肝存在很多问题，如抗HBV没有特效药，药物的不良反应多，药物依赖性强、价格昂贵等[3]。中药土贝母为葫芦科植物土贝母Bolbostemmapanicultum（Maxim.）Franquer的干燥块茎,具有散结，消肿，解毒的功效[4]。笔者前期研究发现土贝母的主要活性成分土贝母皂苷在体内外对HBV都有一定的抑制作用[5-6]，为进一步研究土贝母抗HBV的作用，本实验观察了土贝母冷浸液体外抗HBV的作用，现报道如下。

1.材料与方法

1.1材料

HepG22.2.15细胞为HBV（adw亚型）全基因转染的人肝癌细胞株、土贝母、拉米夫定(3TC)、MTT、FITC标记的羊抗人-IgG、ELISA试剂盒、HBV-DNA荧光定量PCR检测试剂盒。

1.2方法

1.2.1土贝母冷浸液制备土贝母粉末（100g），加入三蒸水（1000mL），放入4℃冰箱，15d后离心收集浸出液，置恒温磁力搅拌器上浓缩至100mL，浓度相当于每毫升含1g生药量，过滤除菌，分装，置-20℃保存备用。临用前采用2%DMEM维持液配制成实验浓度。

1.2.2细胞培养及实验分组用10%DMEM完全培养液培养HepG22.2.15细胞，5%CO2、37℃孵箱中培养。0.25%胰酶消化生长状况良好的HepG22.2.15细胞，配置成1×105个细胞/mL，分别接种于96孔、24孔培养板中，待细胞贴壁后换含不同浓度（4、8、16、32?g/mL）土贝母冷浸液，分别培养2天、4天、8天。每24h换液一次，收集上清保存-20℃备测。同时设细胞对照组及阳性药物拉米夫定组，空白孔不加细胞,只加培养液。

1.2.3MTT比色法观察药物对细胞的毒性每孔加入10?LMTT溶液（5mg/mL），在37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，弃去上清液，每孔加入150?LDMSO，振荡器上振荡5～10min，用酶标仪在450nm波长下测定每孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.2.4ELISA法检测HBsAg、HBeAg的量生长良好的HepG22.2.15细胞以7000个/mL的浓度接种于96孔板，每孔100?L。第二天弃去上清，实验组中分别加入土贝母冷浸液32、16、8?g/mL，阳性对照3TC组50?g/mL；阴性对照组加入维持液，每孔200?L，每组6个复孔。2、4、8d收集细胞上清液于-20℃保存，按试剂盒说明书分别检测HBsAg、HBeAg。

1.3统计学处理

数据以（x-±s）表示，应用SPSS17.0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2.结果

2.1MTT法测定土贝母冷浸液对细胞的毒性

实验表明，在2、4、8d中，土贝母冷浸液在4?g/mL～32?g/mL浓度之间毒性随着浓度的升高而升高，细胞存活率随着浓度的升高而降低，高浓度组在倒置显微镜下可见细胞成空泡、肿胀，甚至破裂。（表1）

2.2土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg的影响实验提示：随着时间延长，抑制作用减弱。（表2）（表3）

3.讨论

中药汤剂是液体复合分散体系，是我国应用最早、最多的一种剂型，以水为溶剂，制作方便，价廉便宜，起效又较为迅速，在中医临床仍然广泛使用。本实验使用土贝母冷浸液为三蒸水4℃浸泡土贝母粉末15天过滤而得，很好的保存土贝母中水溶性药物成分。以上结果证明了土贝母冷浸液在一定浓度下可以抑制HBsAg、HBeAg，但其作用机制还有待进一步的研究。

【参考文献】

[1]于琨，张小龙，赵婷，马鹏娟，等.太行菊提取物对乙型肝炎病毒的抑制作用[J].药物评价研究，2016,39（1）:61-66

[2]王宏亮，刘夏玲，曹爽.抗乙型肝炎病毒药物的研究进展[J].国际药学研究杂志，2016,43（1）:134-138

[3]傅超，李晨.应用2215细胞研究中药抗乙肝病毒的进展[J].中国生化药物杂志，2015,2（35）:180-185

[4]王卫锋,李凡,崔晓敏,郭五保,等.土贝母中土贝母苷甲及土贝母总皂苷提取工艺研究[J].陕西中医,2015,36(5):612-614.

[5]周艳萌,吴中明,向晓波.土贝母皂苷体外抗乙型肝炎病毒的药效研究[J].时珍国医国药，2006,17（11）:2134-2136.

[6]周艳萌,吴中明,向晓波,王欢，等.土贝母皂甙体内抗乙型肝炎病毒的实验研究[J].遵义医学院学报，2007,30（3）:232-235.

基金项目：贵州省科技厅课题（黔科合J字[2005]2073号），SupportedbyProjectsofScienceandTechnologybyGuizhouprovince.