血小板冰冻后凝血质量的变化对比分析

蔡莉莉

蔡莉莉

（商丘市第一人民医院输血科河南商丘476100）

摘要：目的：探讨不同降温速率制备方法对冰冻血小板凝血质量的影响，以选择最优降温速率。方法：收集16例健康捐血者200ml全血，制备浓缩血小板，按照不同冷冻速率（A组1℃/min、B组10℃/min、C组20℃/min）冰冻血小板，储存1周后复温，测定血小板凝血质量，与对照组（新鲜血小板）及（D组）非程序降温组比较。结果：A、B、C、D组血小板计数均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。B组血小板计数、回收率及聚集率均明显高于A、C、D组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。A、C、D组CD42b水平明显低于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A、C、D组CD62p水平明显高于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组CD41与对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：冰冻血小板凝血质量受降温速率影响比较大，10℃/min为最优降温速率。

关键词：降温速率；冰冻血小板；凝血质量

Afterfrozenplateletclottingchangesinthequalityofanalysis

Lilytsai

(shangqiufirstpeople'shospitaltransfusionhenanshangqiu,476100)

Abstract:objective:tostudythedifferentcoolingrateofpreparationmethodsonthequalityofthefrozenplateletclotting,toselecttheoptimalcoolingrate.Methods:collect16casesofhealthydonors200mlwholeblood,preparationofconcentratedplatelet,accordingtodifferentfreezingrateof1℃/min(groupA,groupB10℃/min,20℃/min)groupCfrozenplatelet,storageafter1weekaftertemperature,determinationofplateletclottingquality,andthecontrolgroup(freshplatelets)andgroup(groupD)processcooling.Results:A,B,C,Dgroup,plateletcountweresignificantlylowerthancontrolgroupstatisticallysignificantdifference(P<0.05).Count,recoveryrateandplateletaggregationrateofgroupBweresignificantlyhigherthanthatofgroupA,C,D,statisticallysignificantdifference(P<0.05).CD42blevelA,C,Dgroupwasobviouslylowerthanthatofcontrolgroup(P<0.05),therewasnostatisticallysignificantdifferencecomparedwiththecontrolgroupB(P>0.05).CD62plevelA,C,Dgroupwasobviouslyhigherthanthatofcontrolgroup(P<0.05),therewasnostatisticallysignificantdifferencecomparedwiththecontrolgroupB(P>0.05).GroupsofCD41comparedwithcontrolgroup,therewerenostatisticallysignificantdifference(P>0.05).Conclusion:frozenplateletclottingqualityaffectedbythecoolingrateisbigger,10℃/minfortheoptimalcoolingrate.

Keywords:coolingrate;Frozenplatelet;Qualityofbloodcoagulation

目前国内临床上多采用血小板制剂来预防和治疗由血小板数量不足或者功能不良所引起的出血性疾病，多采用输注[1]。临床常用的血小板产品为冰冻血小板、单采血小板、从全血分离的浓缩血小板3种。由于常温环境下制品保存时间短，临床急救时单采血小板以及浓缩血小板往往很难得到保证；冰冻血小板保存期可长达1a，能满足急救需求，但由于冰冻血小板在制备过程中经过了冻存，其应用效果存在较大争议[2]。冰冻保存剂及其加入方式、降温速率、储存温度及复温温度等因素都会影响冰冻血小板的凝血质量。降温速率对血小板的影响一直是冰冻血小板制备的焦点问题，降温速率对冰冻血小板凝血质量具有直接作用。本文拟在不同降温速率下制备冰冻血小板，对其凝血质量进行比较，以期能够选出最优降温速率，为冰冻血小板的制备提供参考。

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂全自动血细胞分析仪（MetBC-2800）；深低温冰箱（Forma8500-23）；冷冻离心机；血液凝聚仪（SH-93）；程序降温仪；FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest分析软件。主要试剂包括二甲基亚砜、阿米洛利、硝普钠、腺苷、FITC标记抗人CD42b、PE标记抗人CD62p、PE/Cy5标记抗人CD41。冷冻保护剂由硝普钠0.7mg、阿米洛利3.3mg、腺苷1.3mg溶于1ml二甲基亚砜中，使用时与浓缩血小板以1:50混合，并使二甲基亚砜浓度保持为2%。

1.2浓缩血小板制备收集16例健康捐血者200ml全血，加入抗凝剂，二次离心法制备浓缩血小板。将浓缩血小板分为4组，各1ml，均加入新制备的冷冻保护剂。以剩余部分新鲜血小板作为对照组（新鲜血小板组）。4组血小板中，3组（A组、B组、C组）先按不同冷冻速率（1℃/min、10℃/min、20℃/min）将温度降至-80℃，然后放于深低温冰箱进行储存，剩余1组（D组，非程序降温）直接以-80℃于深低温冰箱进行储存，1周后进行复温，行各项指标检测。

1.3观察指标及检测方法冷冻前和复温后血小板计数由全自动血细胞分析仪检测，并计算血小板回收率（复温后血小板计数与冷冻前血小板计数之比）；血小板聚集功能采用5.6mmol/ml肾上腺素作为诱导剂，应用血液凝聚仪记录血小板聚集曲线，测算血小板聚集率；采用直接法测定血小板CD42b、CD62p、CD41的表达情况，PBS30μl、血小板5μl依次加入流式专用试管中，分别加入FITC标记抗人CD42b、PE标记抗人CD62p、PE/Cy5标记抗人CD41，常温孵育，洗涤、离心后加入1%多聚甲醛300ml，用流式细胞仪测定。

1.4统计学处理研究数据采用统计学软件SPSS20.0进行处理。定量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；定性资料采用百分比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1血小板计数、回收率及聚集率A、B、C、D组血小板计数均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。B组血小板计数、回收率及聚集率均明显高于A、C、D组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2流式细胞仪检测结果A、C、D组CD42b水平明显低于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A、C、D组CD62p水平明显高于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组CD41与对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1冰冻血小板复温后各项指标测定情况比较

3讨论

血小板是血液重要的组成成分，在机体凝血过程中发挥止血功能。在临床上，对各种原因引起的血小板减少性出血以及功能障碍性出血，输注血小板具有不可替代的治疗价值[3]。但是因为血小板寿命较短，结构和功能容易受各种因素影响，体外保存不易，血小板体外如何较好保存则成为当前研究的一大热点。冰冻被认为是延长血小板保存时间的较好选择[4]。细胞的低温生物物理特性对低温保存尤为重要，降温速率是其重要影响因素之一[5]。降温的速度过快，细胞内的水来不及从细胞内渗出，则会导致胞内冰晶形成，造成细胞严重损伤；慢速冷冻过程中，细胞外液的水分不断结冰导致大量的水分由胞内渗出，促使胞内渗透压升高。导致“溶质效应”[6]。目前常用方法均为非程序性降温，不能较好地控制降温速率，存在较多不可控的影响因素，对血小板保存不利。因此，有必要找出冷冻保存的最佳降温速率，既防止“胞内冰”的形成，又使“溶质效应”最小化。

本文在不同降温速率下制备冰冻血小板，对其凝血质量进行比较。各组降温速率分别为1℃/min、10℃/min、20℃/min，并设置对照组（新鲜血小板）及非程序降温组进行对比。研究结果显示，A、B、C、D组血小板计数均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。B组血小板计数、回收率及聚集率均明显高于A、C、D组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。该结果说明，10℃/min降温速率对血小板的破坏较小，能提高血小板回收率，并保证血小板的聚集作用，提高冰冻血小板的凝血功能。CD42b介导血小板参与止血，CD41则是鉴别血小板的一种膜复合物，CD62p则直接反应血小板活化程度。A、C、D组CD42b水平明显低于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；A、C、D组CD62p水平明显高于对照组（P＜0.05），B组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；各组CD41与对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。该结果表明，10℃/min降温速率下冰冻血小板活化程度较其他组低。综上所述，冰冻血小板凝血质量受降温速率影响比较大，10℃/min为最优降温速率。

参考文献

[1]叶有玩，谢紫斌，何春辉，等．冰冻机采血小板用于急性严重失血患者的治疗性输注[J]．国际检验医学杂志，2006，27(1)：87-88．

[2]王利民，刘芹，王雪梅，等．冰冻血小板几项理化指标检测及疗效观察[J]．中国输血杂志，2005，18(1)：41．

[3]刘景汉，车辑．血小板保存[J]．中国输血杂志，2008，2l：24l-242．

[4]VaIeriCR.Cryopresenrationofhumanplateletsandbonemarrowandperipheralbloodtotipolentialmononuclearstemcells[J]．AnnNYAcadSci，1985，459：353-366.

[5]刘景汉，欧阳锡林，吕留彩，高大勇．低温保存的血小板胞内冰晶形成温度测定[J]．中国实验血液学杂志，2002，10：574-576．

[6]华泽钊，任禾盛．低温生物医学技术[M]．北京：科学技术出版社．1994：23-24．