聚合酶链反应DNA扩增对活动性肺结核的诊断价值

曹君

曹君（沈阳市和平区疾病预防控制中心结核病防治所110000）

【摘要】为探讨聚合酶链反应（PCR）DNA扩增对诊断活动性肺结核的临床价值，本文用PCR技术扩增结核杆菌特有的MPB64蛋白基因序列，对121例病人临床标本进行检测，发现34例活动性肺结核中有28例PCR阳性，疑诊为肺结核者33例中有18例阳性，非结核肺疾患54例中有10例阳性，其中有肺结核既往史者阳性6例，有结核接触史者阳性3例。提示PCR阳性并非为活动性肺结核所特有。

【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）32-0131-02

结核菌属生长缓慢菌，培养分离大约需8周，BACTEC系统虽可能缩短培养时间，也需1-2周。PCR技术结核杆菌（TB）DNA扩增可缩短检出时间，但是在实际检测临床标本时，PCR结果对肺结核诊断的价值尚未确定。本文用PCR方法扩增结核杆菌MPB64蛋白DNA序列，对121例患者的痰、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液和胸水等标本进行检测，以评价PCR结果对肺结核临床的诊断的意义。

一、资料和方法

1病例及临床标本

121例住院病人，根据结核菌检测阳性，胸部X线检查有活动性结核病变的特征表现，肺或胸膜标本病理诊断为结核及临床已排除其它原因引起的胸膜炎等，共确诊肺结核34例(继发性肺结核19例；粟粒型肺结核1例；结核性胸膜炎14例)；依据胸部X线检查怀疑活动性肺结核或有异常阴影伴低热、咳嗽、盗汗等按肺炎治疗2周观察，未见吸收，疑似肺结核33例。除外肺结核54例（肝癌18例；支气管哮喘2例；肺炎15例；癌性胸水19例），其中既往有肺结核史者10例，结核接触史者7例，入院后取晨痰，纤支镜下取支气管冲洗液或支气管肺泡灌洗液，经胸穿取胸水标本，用结核杆菌标准菌株DNA作为阳性对照，无菌生理盐水作为阴性对照。

2PCR检测

标本经前处理后，DNA提取按Hermans介绍的方法进行，引物按Manjunath等报告的寡核苷酸序列。

引物Ⅰ：5′-GCTCTCGCGAGTCT-AGGCCA-3′

引物Ⅱ：5′-TCCGCTGCCAGTCGTC-TTCC-3′

DNA扩增在25ml反应体系内含10X扩增缓冲液2.5ml，引物混合物2ml，4X核苷酸2ml，标本DNA模板5ml，Tag聚合酶1.5u,置扩增仪内扩增，92℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸40秒，循环30次，最后延伸300秒。取扩增产物5ml,2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下检测，阳性者可见240bp区带。

3抗酸染色。

各标本涂片按萋尼氏法进行抗酸染色，在油镜下观察300个视野，3个菌以上为阳性。

三、结果

1.PCR检测结果

121例中，活动性肺结核34例，PCR阳性28例，疑似肺结核33例，有18例阳性，除外肺结核54例有10例阳性（表一）

不同病种PCR扩增结果（%）

2.抗酸染色与PCR结果的关系

121例抗酸染色阳性11例，同时PCR阳性10例。

三、讨论

本组研究用结核分枝杆菌MPB64蛋白编码基因部分序列为引物进行PCR检测。MPB64蛋白为结核分枝杆菌复合群（MTBC）所特有的蛋白质，用其编码基因部分序列作为引物，对MTBC的细菌具有很高的特异性，可将MTBC与其他分枝杆菌区别开来，可检出相当于10个结核杆菌的DNA，而涂片抗酸染色标本含菌须在5000-10000个/ml,才能出现阳性。本研究活动性肺结核34例标本抗酸染色阳性11例，占32.4%（11/34），而PCR阳性82.4%(x2检测，P＜0.05)，可见PCR技术作为更敏感的方法可明显地提高结核菌的检出率。临床疑似肺结核患者PCR检测阳性占54.5%（18/33），提示PCR检测在疑似肺结核病的诊断中有一定意义，但该部分PCR阳性病例是否就可确诊为活动性肺结核尚需进一步研究。

非结核组54例有10例PCR呈阳性，此中有结核病既往史者10例，PCR阳性6例，有结核密切接触者7例，PCR阳性3例。这些患者PCR阳性的出现显然会给临床诊断活动性结核带来一定困惑。根本原因可能与以下因素有关：①肺结核临床治愈后，结核菌仍可在肺内残留，并可少量间断地排除体外，用常规细菌学方法很难检出，而用非常敏感的PCR方法有可能检出；或治愈后肺内有结核死菌和DNA残留，其基因片断可被PCR方法扩增出现阳性；②临床无症状或症状很轻的结核菌L型感染所致“无反应性结核病”，临床上未诊断为肺结核，但其细菌DNA可被PCR方法检出；③本研究虽使用了防止检测交叉污染措施，但也难免有检测污染所致的假阳性。故如何排除假阳性是PCR结果分析所面临的一个重要课题。

本组活动性肺结核有17.6%PCR阴性，原因尚不清楚，可能是排菌极少或间断排菌；标本中含有Tag酶抑制剂；L型结核菌胞壁缺陷及细胞膜代偿性增厚等致DNA提取困难。另有1例抗酸染色阳性但PCR阴性，除以上因素外，可能与非典型分枝杆菌感染有关。

本研究发现，PCRTB-DN扩增诊断活动性肺结核较涂片抗酸染色阳性率高但特异性差，且其阳性并非活动性结核所特有。总之，用结核菌PCR-DNA扩增作为临床诊断活动性肺结核的常规项目，目前尚存在一些问题，需在检测技术上改进以减少交叉污染，同时也应在结核病基础理论方面进一步研究，从而更好地用PCR结果来解释临床现象。

参考文献

[1]屠德华.《关于制订肺结核病诊断标准的意见》.中国防痨通讯，1990，12：86.

[2]侯淑莲，孙秀娟，张惠荣，等.《应用PCR检测脑脊液中结核杆菌的研究》.中国防痨杂志，1994，16：121.

[3]黄谷良，林特夫，郭秉兰等编著.《细菌L型与疾病》.北京:学苑出版社，1991：40.