浅谈糖化血红蛋白检测

戴雨希

戴雨希(南京市秦淮区止马营社区卫生服务中心江苏南京210000)

摘要：目的:探讨目前常见的各种糖化血红蛋白检测方法及其在临床实践中的应用价值。方法:介绍了离子层析法、电泳法、亲和层析、离子捕获法和免疫凝集法在临床检测糖化血红蛋白中的应用。结果:糖化血红蛋白测定方法众多,但离子交换层析法精密度高,重复性好,且操作简单是目前最适合临床开展的检测方法。

关键词：糖化血红蛋白;检测;应用价值

正常人有三种血红蛋白:HbA,HbF,HbA2,而成人红细胞中主要含有HbA。在用层析法分离血红蛋白时,可洗脱出3种含糖成分即:HbAla,HbAlb,HbAlc,合称为糖化血红蛋白。糖化血红蛋白是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。糖化血红蛋白越高表示血糖与血红蛋白结合越多,糖尿病病情也越重。血糖是通过弥散方式进入细胞内的,无需胰岛素参与。血糖与血红蛋白的结合过程很缓慢,而且是不可逆的,在红细胞死亡之前一直存在,故体内衰老红细胞比新生红细胞的糖化血红蛋白含量约高出1.5倍。每一个红细胞内都有血红蛋白,而红细胞的寿命为120d,平均60d,所以糖化血红蛋白比例,能反应测定前1个～2个月的平均血糖水平。糖化血红蛋白(HbAlc)检测用于常规实验室始于20世纪70年代末期,且稳定发展至今,检查糖化血红蛋白已成为了解糖尿病控制良好与否的重要指标。国外已将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”。目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两类:一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子层析法、电泳等方法;另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析、离子捕获法和免疫凝集法等。其中高压液相离子层析法(HPLC)被公认为金标法。

1离子层析法基于血红蛋白β链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同,在偏酸溶液中,GHb及HbA均匀具有阳离子的特性,因此,当它们经过阳离子交换层析柱时,就可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附,但GHb与HbA对抗脂吸附率不同,用PH6.8的磷酸盐缓冲液可以先将正电荷较少,吸附率较弱的GHb漂洗下来,再用PH6.4的磷酸盐缓冲液洗脱正电荷较多,吸附率较强的HbA。KCN可将Hb转化为高铁氰化血红蛋白,用分光光度计测定。

2手工微柱法有Bio-Rad和西班牙BIOSYSYEMS等多家公司产品,手式微柱操作会受到人工因素影响,可能会洗脱不完全或过度洗脱并受外界环境温度的影响,而某些血红蛋白如HbF异常增加时,也会与糖化血红蛋白同时洗脱,从而使结果产生偏差。相应的仪器以英国DREWSCENTIFIC公司DS5糖化血红蛋白仪为例(BIO-RAD公司DIASTA亦为同一产品),采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术可全自动分离血红蛋白的变异体与亚刑,除可测定糖化血红蛋白外,还可同时检测出HbS与HbC的存在与否,在计算糖化血红蛋白值时会自动扣除变异体产生的影响,从而使结果更为准确,可靠,CV值<2%。同时该仪器配有专门的稀释溶血器,可直接进行全血操作,5min即可报告结果,并自动储存样品检测结果,层析柱价格也较为低廉,适合于较多标本的医院检测。离子层析法精密度高、重复性好且操作简单,己被临床广泛采用。国内主要采用Bio-Rex70阳离子树脂微柱层析法,其微柱可重复使用多次。

3高压液相法(HPLC)近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术较为准确,除对糖化血红蛋白测定外还对血红蛋白各组分进行分析。但手工微柱法操作受到操作因素的影响,可能会导致洗脱不完全或过度洗脱,并受外界温度、某些异常血红蛋白的影响而使结果发生偏差。仪器法采用微拄法离子交换层析和梯度洗脱技术可全自动分离血红蛋白的变异体与亚型。这类方法虽然操作快速,技术简单,但是要特别注意控制标本量和分离时的温度,同时要选购具有准确PH值和离子强度的缓冲液和优质树脂,仪器昂贵难普及。目前HPLC法测定HbAlc使其准确性和重复性得到很人的提高。美国临床化学协(AACC)糖化血红蛋白标准化分会和IFCCHbAlC标准化工作组建议,以DCCT研究中所指定的方法,HPLC方法作为检测糖化血红蛋白的金标准,希望以此使人多数的实验方法能够参照指定的方法实现标准化。

4电泳方法Hb及HbA1带正电荷,电泳时向负极移动。因为HbA的β链N-末端所带电荷被糖基消除,带电量少于HbA,等电点低,泳动速度慢,所以HbA1即GHbHb本身带红色,所以可直接比色或扫描。用HbA1占Hb的量来表示。毛细管电泳也能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。普通电泳法对HbA和HbAl分离效果不理想,目前尚无商品化,具有批量样本通过能力的仪器面世,相当程度地限制了该方法的临床应用。

5离子捕获法近发展起来的新方法,代表仪器有Abbott的IMX,其原理是糖化血红蛋白与相应抗体结合后,联以荧光标记物,形成一反应复合物,再联结带负电荷的多聚阴离子复合物,而在MX反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物,使纤维表面带正电,使前述的反应复合物吸附在纤维表面,经过一系列清洗后测定其荧光强度,从而得到糖化血红蛋白的浓度,该方法适用于成批糖化血红蛋自标本的检测。

6免疫凝集法糖化血红蛋白与相应的单抗结合进而发生凝集反应,通过测定吸光度来表示凝集量,可用于全自动生化分析仪上进行测定。以免疫分析为基础的仪器(DCA2000)在最近几年中得到推广,人约在7min内就能读取数据,要求对样品成批试验,每次试验均应使用一个新试剂盒,操作前应注意混匀试剂。

需要指出的是免疫凝集法测定糖化血红蛋白受到的干扰,一是使用针对β链N末端6个氨基酸结构有特异性的单克隆抗体,但对Hb-F的γ链N末端没有特异性,因为在6个氨基酸中有3个不一样,使抗体捕捉不到糖化的Hb-F,使测量值偏低,测量结果依Hb-F的量的多少等比例减少,精密度较差,CV值一般>6%。

综合现在临床实验室中常用的GHb测定方法,因为原理的不同,测定的结果准确度、重复性都有所差异。相信随着对HbA1c实验方法标准化的重视和提高,HbA1c项目的检测在临床会得到越来越多的应用。

参考文献:[1]赵树铭,李祝全.糖化血红蛋白检测意义[J].中国检验医学与临床,2000,6(1).[2]陈玲玲,陶耕.对三种糖化血红蛋白测定方法的比较[J].齐齐哈尔医学院学报,2004,25(9)”1033-1034.[3]郑莉.糖化血红蛋白检测意义[J].中华现代临床医学杂志,2006,4(23).