同型半胱氨酸致足细胞损伤中miR-92a的表达

詹学良徐灵博和杨杨毛彩艳丁宁贾月霞徐

(宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004)

【摘要】目的：为了观察同型半胱氨酸致肾脏足细胞损伤的机制，进而为同型半胱氨酸致肾脏损伤的分子机制提供理论依据。方法：培养小鼠肾脏足细胞后，并用0，10，20，60，80μmol/L同型半胱氨酸干预，采用MTT方法检测不同浓度同型半胱氨酸干预下足细胞的抑制率。提取足细胞RNA，进行逆转录后采用qRT-PCR的方法检测肾脏足细胞miR-92amRNA的表达。结果：与正常对照组相比，同型半胱氨酸浓度为10、20、60和80μmol/L足细胞存活率下降，并且呈浓度依赖性。qRT-PCR结果显示在不同浓度的同型半胱氨酸作用下，miR-92amRNA表达随着同型半胱氨酸浓度的增高，表达增多。结论：miR-92a可能参与了同型半胱氨酸导致的肾脏足细胞损伤。

【关键词】高同型半胱氨酸；足细胞损伤；miR-92a

【中图分类号】R69【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）21-0200-03

对同型半胱氨酸进行了解，其在人体中发挥一定作用，但是加入其在代谢方面出现问题那么则会导致患者出现心血管或者是肾病方面疾病，进而发展为终末期的肾病，对患者身体造成严重影响。但是，关于患者因同型半胱氨酸过高而导致肾部出现损伤原因至今未有明确解释。足细胞即肾小囊脏层上皮细胞，它附着于肾小球基底膜(GBM)的外侧，足细胞损伤与肾脏功能异常有密切关系。microRNA（miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。现今，关于miRNA方面的研究已经成为国内生物医学领域所研究的重点内容，且在研究中也被证明与糖尿病以及肾脏疾病等有一定关系[1]。并且，有文献报道miR-92a在肾脏中固有高表达并且与肾小球发育成熟有关[2]。因此本课题选择miR-92a，来进一步探讨高同型半胱氨酸所致的肾损伤过程中，是否有miR-92a的参与，为HHcy所致肾脏疾病的预防和治疗提供理论和实验依据，为肾病患者的疾病监测提供新的指标。

1.材料和方法

1.1相差显微镜（Nikon公司）

仪和凝胶成像系统(Bio-Rid公司)；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；高速低温离心机和CO2孵箱（Heraeμs公司）；精密天平（公司，pH测定仪（Jen-wayLtd公司）；低速离心机（上海安亭仪器厂）。青霉素、链霉素、缓冲液、培养基、胎牛血清（hyclone公司）；胰蛋白酶、D-Hanks液、同型半胱氨酸(Sigma公司）；红细胞裂解液（北京康为生物技术公司）；RNA提取试剂盒（Promega公司）；荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；MTT溶液；(取100mgMTT溶于20mLpH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液中，充分溶解后过滤除菌，4℃避光保存)、三联溶解液(SDS10g，异丁醇5mL，10mol/LHCl0.1mL，用双蒸水配成100mL溶液)Model680全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；BS110S型精密天平(德国Sartoriμs公司)。

1.2足细胞的培养

向培养瓶内加入4mL含20%胎牛血清的DMEM/F-12培养液，置37℃、5%CO2孵箱培养，3天后换新鲜培养液，以后每天换液1次，待细胞融合度达90%时传代。取第3代细胞用于实验，将细胞分别置于终浓度为0、10、20、60、80μmol/L高同型半胱氨酸的培养液中孵育48h以备后续实验使用。

1.3MTT检测不同浓度Hcy刺激后足细胞的抑制率

取正常以及经10、20、60、80μmol/LHcy刺激的足细胞于96孔细胞培养板中(重复3孔)，分别加入MTT溶液至终浓度0.5mg/mL。同时设置空白对照，混匀后置于37℃，30min后取出培养板，加入三联溶解液100μL，充分溶解后测定OD578值。对同一份样品同时进行细胞计数，分别加入MTT溶液至终浓度0.25、0.5和0.75mg/mL。混匀后于合适条件下培养，间隔30、60、120、180、240、300min取出培养板，加入100μL三联溶解液充分溶解后测定OD578值。

1.4qRT-PCR检测miR-92amRNA表达

取已培养的足细胞，Trizol提取RNA。20μL逆转录体系，逆转录合成cDNA。通过Primer5软件设计miR-92a引物:上游引物:5'-TCAGTGGGAAGTGCTATCAGG-3'，下游引物:5'-GAGAGTGGAGTGGTGCTGTTCCAA-3'，产物长度：磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH）上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游引物：5'-CTCGCTGGAAGATGGTG-3'，产物长度为186bp。反应体系：模板DNA1μL，mix12.5μL，上下游引物1μL，加无核酸酶水至25μL，反应条件为:95℃10min，95℃15s，53℃30s，72℃30s，进行40个循环。反应后取最终产物3在2%琼脂糖凝胶中100V电泳30min，紫外线照相分析光密度，每组实验重复3次。PCR仪反应程序：95℃20s，95℃10s，60℃20s，72℃10s，共40个循环，以GADPH作为内参对照。根据目的基因的相对量=2-△△Ct计算结果，引物设计（广州锐博公司）。

1.5统计学分析统计学分析结果以表示

两样本均数间比较采用Stμdents’st检验,多样本均数间比较采用one-wayANOVA检验，组间的两两比较采用Stμdent’s-new-man-Keμls检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1MTT检测Hcy对肾足细胞的抑制率

不同浓度的Hcy分别作用细胞24h、48h和72h后显示，随着Hcy浓度的升，Hcy对细胞的凋亡率也明显升高，呈现出剂量依赖、关系，尤以80mol/L浓度组最为明显。与对照组相比，Hcy对细胞的凋亡率升高了大约2.84倍，差异有统计学意义(P＜0.001)。20μmol/L组、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L组与对照组相比抑制率分别上升了1.09倍、1.1倍、2.16倍和2.84倍，差异具有显著(P＜0.05,P＜0.001；图1)。

图2miR-92a在各组足细胞中的表达

3.讨论

肾脏排泄体内代谢废物，维持机体钠、钾、钙等电解质的稳定及酸碱平衡的功能，肾功能检查包括血肌酐、血尿素氮、血及尿白蛋白、尿免疫球蛋白G、尿分泌型免疫球蛋白A等，肾损伤可以引起肾脏功能的异常。

Hcy作为一种含疏基的氨基酸，其能够在人体不断氧化中产生大量的活性氧，但这种活性氧对人体有一定损害，能够对人体的肾脏以及皮下细胞方面造成严重损伤。如果想要在体内将这种物质所代写，那么则就要在肾部存有一定的甜菜碱来对甲基作为供体，且在两者的参与和转换下而生成二甲基甘氨酸或者蛋氨酸等物质。当患者出现肾脏损伤时，那么其体内会因存在大量的Hcy，进而造成患者血液中的Hcy出现增高。但是，如果Hcy过高的话，则会对患者肾脏肾小球基底膜功能受到影响，也会阻碍患者体内甘肽合成，进而对患者心血管造成影响。一般来说，如果患者出现Hcy升高，那么其肾小球滤过率必然会出现降低情况，且对患者肾脏代谢能力造成严重影响。对现今国内外关于Hcy的一些报道进行查阅，发现诸多相关学者在其研究中都会将Hcy与肾脏疾病进行共同研究以及提出自己观点，大多学者还是认为两者之间是有一定关联的[4]。所以，在本文中可以对Hcy疾病相关联病症进行肯定，如尿毒症、糖尿病、高血压性的肾病，甚至在一些心脑血管方面都会受到一定影响。但是目前高同型半胱氨酸通过何种途径引起的肾脏损伤的机制并不清楚。

通过以上研究和分析，以及对国内外相关学者的相关论著研究的了解，能够认定miRNA对人体疾病产生有一定作用。而现今，更多学者会通过患者血清与尿中所含miRNA进行分析，希望从其中能够了解到出现肾脏疾病的重要生成原因[5]。而通过这两种方式所了解是有一定科学道理的，因血清与尿在表达上较为稳定，且患者所出现病症情况都能从这两方面检测中表达出来，说明这两种方式与疾病病理变化方面还是有一定联系的[6]。并且，已有研究证实，miR-92a在肾脏中稳定表达，因此我们选择miR-92a作为研究对象。

本文结果显示，随着Hcy浓度的显著升高，肾脏足细胞的抑制率增加，说明Hcy与肾损害有关，并且随着Hcy浓度的升高，miR-92a的表达增多，说明miR-92a可能参与Hcy引起的肾损害。

综上所述，Hcy与肾损害程度密切相关，并且miR-92a表达与其有关。本课题为研究肾脏损伤机制和临床预防、治疗肾脏疾病建立新的理论基础及提供新的思路。

【参考文献】

[1]段俊丽，李月，王一尘，等．过量服用蛋氨酸所致高同型半胱氨酸血症对缺血性血管新生的抑制作用[J]．中国动脉硬化杂志，2003，11(6):493497．

[2]李录，贾绍斌，孙娜．同型半胱氨酸对内皮细胞Bcl2基因甲基化水平的影响[J].中国动脉硬化杂志，2013，21(12):1075078．

[3]杨志娜，田卫东，胡金川，等．高同型半胱氨酸血症与肾脏疾病的相关研究[J].国际检验医学杂志，2013，34(5):630631．

[4]韩园园，魏仲南．MMP9/TIMP1在肾间质纤维化过程中的作用机制及中医药对其干预的研究进展[J].中国医药指南，2013，11(3):4041．

[5]巩慧慧，王菊，孙炜炜，等．HHcy对ApoE―/―鼠动脉粥样硬化的影响及叶酸、维生素B12的干预效应[J].中国现代医学杂志，2012，21(36):4493496．

[6]王金会，滕志涛，赵培勇，等．紫杉醇对小鼠心肌及血管内皮细胞凋亡影响的实验研究[J].中国心血管病研究，2008，6(6):460462．