应用实时荧光定量RT-PCR检测急性粒细胞白血病患者AML1/ETO融合基因的临床意义分析

李海凤

李海凤(黑龙江省鹤岗市岭北人民医院检验科154101)

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）4-0215-03

目前白血病主要治疗原则是使患者获得尽可能长的完全缓解期，但仍有很多患者达到缓解后会出现复发，这是临床治疗白血病的最大难题之一，这也说明了现在采用的治疗方法并不能完全的杀死患者体内的异常细胞，临床上把这种状态称为微小残留状态或微小残留病(MRD)，即患者经治疗后，即使达到临床和血液学完全缓解，体内仍有106～108个残留白血病细胞，这些残留的白血病细胞就成了复发的主要根源。因此能够准确的检测MRD将有助于反映患者体内自血病细胞负荷，初步评价治疗效果，估计患者复发危险度。

现在检测MRD的技术敏感性、特异性和可重复性相对较高的是实时荧光定量PCR，但是此方法的标准品建立是成功的关键。本研究通过构建AML1/ETO融合基因的RNA标准品，并以此融合基因为标志物，利用RQ-RT-PCR对急性粒细胞白血病M2亚型患者的MRD进行监测，进而探讨此方法临床应用价值。

1材料与方法

1.1病例

收集2007年～2010年到我院就诊患者的骨髓及外周血标本，37例患者根据FAB分型均为急性粒细胞白血病M2亚型，其中男17例，女20例，男女比例0.85：1，年龄从16岁到80岁，中位年龄为50岁。骨髓及外周血共55份标本，其中初诊25份，复发6份，缓解11份，部分缓解2份。

1.2试剂

引物合成、RNAPCR(AMV)Ver.3.0、RNALAPCRTMKit(AMV)Ver.1.1、质粒PMD-18T、大肠杆菌感受态细胞JM-109、反转录试剂和PCR试剂均为大连宝生物工程公司产品；管家基因ABL的标准品：本实验室保存，详细方法参见参考文献。

1.3方法

1.3.1RNA标准品构建

(1)总RNA提取：分别取9例患者骨髓1ml分离单个核细胞，提取总RNA，应用酚/氯仿/异戊醇精制，具体方法参见TaKaRaRNAiso说明书。

(2)引物设计：利用OligoTMPrimerAnalysis软件在人急性粒细胞白血病M2的AML1/ETO基因序列上设计构建引物与定量引物，并在构建上游引物的5′端加上T7启动子，构建用下游引物的5′端加上25个T，使构建的AML1-ETO基因标准品RNA有P0ly(A)尾。

(3)RT-PCR：依照TaKaRaRNALAPCRTMKit(AMV)Vet.1.1试剂盒说明书进行操作，逆转录体系为10μl，其中含模板0.5μl，反应条件为30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反应体系为50μl，以10μl逆转录产物作为模板，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火30see，72℃延伸1.5min，共循环28次，然后72％延伸3min，反应结束取5μl进行琼脂糖凝胶电泳。

(4)目的基因AMLl/ETO标准品构建及鉴定：根据电泳结果(长度为402bp)确定阳性的样本，回收目的片段，与质粒PMD-18T连接。连接产物热转化入大肠杆菌感受态细胞JM-109中，37℃摇床孵育1小时，涂布于MX筛选平板，37℃过夜培养。用挑取阳性单个菌落，移入EP管中，99℃1min，释放质粒。以质粒为模板，BaeBESTrMSequencingPrimerRV-M和BaeBESTrlVlSequencingPrimerM13-47为引物进行PCR反应，反应体系为(10μl)：引物各0.25μl，dNTP混合液4μl，10×LAPCR缓冲液2.5μl，LATaq聚合酶0.25μl，dH2O2.85μl。反应条件为：94℃预变性1min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环，反应结束取8μl进行电泳。挑取转化成功的质粒对应的阳性菌落放入333培养基，37℃过夜培养。从菌体中提取质粒交大连宝生物工程公司进行DNA测序。对测序结果正确的质粒用HindⅢ酶切。用体外转录试剂处理酶切产物，反应体系(20μl)：酶切产物1μl，10×T7缓冲液2μl，NTP混合液8μl，Inhibitor(40U/μl)0.25μl,17Poly聚合酶2μl，DEPC6.75μl。42℃反应2～3小时，得到转录产物，转录产物直接加入50UDNaseI(RNaseFree)，37℃处理3小时，电泳确认，根据电泳结果测定吸光度(A)值，根据阿佛加德罗常数(6.023×1023分子数/t001)换算为分子拷贝数，按1012拷贝/μl浓度，-80℃保存。

(5)RNA标准品反应性能进行检测：将RNA标准品梯度稀释(108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μl)作为模板进行实时荧光定量PCR反应，制作标准曲线。为了检测RNA体系中是否还残存DNA，反转录反应做三组体系。反转录反应条件42℃10min，95％2min。PCR反应体系(20μl)：反转录产物2μl，SYBRPremixExTaq(2×)10μl，定量引物各0.5μl，反应条件95℃预变性10sec，95℃变性5sec，60℃退火/延伸20sec，45个循环，最后由60℃升高到95℃制作溶解曲线。

1.3.2RQ-RT-PCR检测M2患者的目的基因AMLl/ETO与管家基因ABL

(1)以提取的患者、阳性对照、阴性对照及不同梯度稀释的标准品的RNA为模板进行反转录反应，反转录体系(10μl)：模板1μl，随机6引物(10μmol/L)0.5μl，5×ExScript缓冲液2μl，dNTP混合液0.5μl，Inhibitor(40U/μl)0.25μl，反转录酶ExSeriptTMRTase(200U/μl)0.25μl，DEPC5.5μl。反转录反应条件42℃10min，95℃2min。

(2)以反转录合成的eDNA为模板进行PCR反应，20μl的PCR反应体系包括SYBRPremixExTaq(2×)10μl，目的基因AMLI-ETO与管家基因ABL的定量引物各0.5μl，dH2O7μl，将配好的PCR反应液每孔分装18μl，按顺序加患者、阳性对照、阴性对照及不同梯度稀释的标准品的eDNA。置于LightCycler定量PCR扩增仪上，反应条件为95℃预变性10sec，95℃变性5sec，60℃退火/延伸20sec，45个循环，由计算机自动将样本与标准曲线对比得出目的基因AMLl/ETO与管家基因ABL的基因水平。

1.3.3统计学处理

用SPSS11.5软件进行统计学处理，统计数据用x-±SD表示，应用Kruskal-WallisH检验方法对数据进行分析。

2结果

2.1调取目的基因AMLl/ETO的结果

以患者标本总RNA为模板，用构建上游引物和下游引物调取目的基因AMLl/ETO，1-9;为目的基因AML1/ETO扩增产物，1号、6号、7号可以见到一条402bp的片段。

2.2目的基因AMLl/ETO的吸光度(A)值检测结果，显示构建的标准品质量良好

2.3CT(thresholdcycle，循环阈值，即产生可被检测到荧光信号所需的最少循环数)值的测定及标准曲线制定。

为了避免平台期效应，我们采用目前国际上公认的CT值来进行定量。1×102～1×108拷贝/μl的目的基因AML1/ETO标准品RNA为模板的CT值分别为35.13、30.94、27.73、24.14、20.59、17.21和13.90，回归系数为0.998。统计学分析显示每个标准品的CT值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，CT值越小。利用已知起始浓度的标准品做出标准曲线，根据未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始RNA水平。

2.4标准曲线的参数

通过分析可以看出目的基因AMLl/ETO曲线可以呈现良好的重复性，可以得到较好的扩增曲线、标准曲线和融解曲线，标准曲线显示线性关系良好(R2=0.998，R2>0.98)，方程为Y=-3.477*LOG(X)+41.63，扩增效率较高(E=93.9％，0.8<E<1.2)，融解曲线显示特异性较好，融解温度在83℃±1℃。重复实验中标准曲线的斜率在-3.012～3.810之间。

2.5方法学评价

我们用阴性患者的RNA按比例从1：10到l：107逐级稀释阳性患者的RNA，得到的灵敏度为10-5；对6例AML1/ETO融合基因阴性的标本进行了检测，未检测到目的基因表达，特异性较好；把同一样本同一批内检测10次，计算批内变异为6％，把同一样本在每次实验时进行检测，一共检测10次，计算批间变异为10％，表明稳定性较好。

2.6RQ-RT-PCR检测M2患者目的基因AML1/ETO的相对值

现有的37个病例中有20个为融合基因阳性的患者，阳性率为54.5％，结果以目的基因的拷贝数与管家基因的拷贝数的比值乘以104来表示。初诊时目的基因的相对值在5.74×105～1.19×103，其中17号患者为双重易位，相对值6.59×107比一般的患者要高出2个数量级。初诊组、CR和复发组的目的基因AML1/ETO的相对值分布散点图，从图中可以看出初诊组的相对值较高，CR组较低，复发组其相对值也呈现高水平状态。初诊组、CR组和复发组目的基因AML1/ETO相对均值，其中初诊组、复发组与CR组相比有很大的差别，统计学分析有显著性差异(P<0.05)。而且每组内最高值比最低值高出大约2个数量级，说明MRD水平在不同的患者存在较大差异。

2.7随访期骨髓标本的MRD定量分析结果

随访的5例患者每次监测的目的基因AML1/ETO的相对值。每个患者目的基因AML1/ETO的相对值随时间变化的图象。

3讨论

目前认为MRD是导致白血病复发的主要原因之一，也是白血病患者不能治愈的主要障碍，因此对MRD的检测技术已成为白血病治疗的一个重要课题。就敏感性、特异性和可重复性而言相对较高是PCR方法。现在单纯的定性PCR已不能满足临床的需要，虽然很多文献报道患者CR后RT-PCR持续阳性可预示复发，但是有人在完全治愈或骨髓持续缓解8年的患儿骨髓中仍可检测到阳性结果，这说明定性PCR阳性并不能确定患者是否存在复发的危险，如果要对MRD进行检测需要敏感性更高的定量方法，目前应用最多的是实时荧光定量PCR，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，因此在很多领域得到了广泛的应用。荧光定量PCR的技术主要的代表为SRBYGreenI染料法和TaqMan探针。本实验应用的是SRBYGreenI双链DNA内插染料法，在实时定量PCR发展早期就是运用的最简单的方法。

总之，通过我们的研究、结合国内外的研究成果可以得出，用RQ-RT-PCR检测融合基因AML1-ETO阳性患者是监测MRD的有效方法，敏感性、特异性较高，重复性较好。融合基因AML1-ETO的表达水平与临床病情发展相关，且应用其对MRD进行检测有重要的预后价值，完全缓解时升高提示患者复发的危险性。由于RQ-RT-PCR可以机械自动化，而且应用外周血检测与骨髓没有差别，使此方法简单易行，我们建议把其当作常规项目进行检测能为临床对M2患者的治疗、病情监测等提供很大的帮助。但本实验的分析患者的数量有限，还需要大量的多方面的实验来证实我们的结果。

参考文献

[1]赖悦云,邱镜滢,江滨,卢锡京,黄晓军,张艳,刘艳荣,史惠琳,陆道培.t(8;21)急性髓性白血病特征和预后分析(英文)[J];中国实验血液学杂志;2005年05期.

[2]袁宏,王楠,李士军,孙国华,程艳杰,肖晓光,黄敏.荧光定量聚合酶链反应检测人急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因方法的建立[J].中华检验医学杂志;2006年03期.