纤维蛋白原β-455G/A基因多态性与血浆纤维蛋白原浓度、

林威陈群

林威陈群（福建省立医院心血管内科/福建医科大学省立临床医学院350000）

【摘要】目的探讨纤维蛋白原β-455G/A（FGB-455G/A）基因多态性与血浆纤维蛋白原浓度（Fg）、下肢深静脉血栓形成（LEDVT）的关系。方法采用病例对照研究的方法收集福建省立医院经下肢深静脉造影确诊的LEDVT患者153例为病例组，同期我院体检及住院患者中无LEDVT者262例为对照组；采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因，采用限制性片段长度多态性（RFLP）区分FGB-455G/A基因多态性，并经测序分析证实；应用SPSS13.0软件分析数据。结果FGB-455G/A各基因型频率、等位基因频率在两组间分布不同；455AA+AG基因型在LEDVT组分布频率高，A-455等位基因在LEDVT组分布频率高（P＜0.05）；血浆Fg浓度在FGB-455G/A基因型之间有差异（P＜0.05），455AA+AG组Fg浓度高于455GG组；多元二项Logistic回归分析显示：在调整了其他因素的作用后，Fg（OR=1.718）和455AA+AG（OR＝1.739）基因型进入最后的方程。结论血浆Fg浓度升高可能是LEDVT的独立危险因素；455AA+AG基因型携带者血浆Fg浓度高，A-455等位基因与血浆Fg浓度升高相关；FGB-455G/A基因多态性与LEDVT有关，455AA+AG基因型携带者LEDVT易感性增加，A-455等位基因可能是LEDVT发病的遗传危险因素。

【关键词】下肢深静脉血栓形成纤维蛋白原基因多态性FGB-455G/A

【中图分类号】R543【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）31-0082-03

静脉血栓栓塞症（Venousthromboembolism，VTE）是临床三大血栓性疾病之一，下肢深静脉血栓形成（Lowerextremitydeepvenousthrombosis，LEDVT）是一种发病率很高的周围血管病，如不及时治疗会严重影响生活质量和工作能力，严重者会引起肺动脉栓塞而导致死亡，探讨LEDVT的病因及防治成为血栓性疾病的重点。

关于VTE的形成机制，德国病理学家Virchow提出三大因素：血流的异常、血液成分的改变、血管的损伤。此外，VTE的形成还和许多危险因子有关，常见的危险因子包括：高龄、制动、恶性肿瘤、手术、创伤、妊娠等[1，2，3]。而VTE相关的遗传基因正逐步被人们所认识，并作为一项独立的危险因子对待，研究表明，在首次发生VTE的患者中至少有20％的人可能存在遗传基因的改变[4]513。目前发现的与VTE有关的基因缺陷主要包括：抗凝蛋白缺乏、FVLeiden突变、凝血酶原G20210异常、高同型半胱氨酸血症等，它们在VTE的发病中具有不可忽视的作用。

纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）即凝血因子I，是凝血系统的核心蛋白质，在凝血过程中发挥重要作用。Fg在分子结构上包含三条多肽链：Aα、Bβ和γ，分别被纤维蛋白原α（FGA）、纤维蛋白原β（FGB）和纤维蛋白原γ（FGG）三种独立基因所编码[5]。研究表明纤维蛋白原β链的合成是Fg合成的限速步骤[6]，FGB基因被认为影响血浆Fg浓度的大部分变化。本研究采用病例对照研究的方法，以福建本地汉族人群为研究对象，应用聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）和限制性片断长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）测定基因多态性，来探讨FGB-455G/A基因多态性与血浆Fg浓度、LEDVT之间的关系。

1资料和方法

1.1研究对象

病例组（LEDVT组）：纳入2007～2009福建省立医院住院的LEDVT患者共153例；纳入标准：根据中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会制定的下肢深静脉血栓形成诊断标准[7]进行诊断，并全部经下肢深静脉造影确诊。对照组：同期在福建省立医院门诊体检及住院患者中无LEDVT病史者262例；排除标准：急性心梗、急性脑血管意外、急性心衰者；恶性肿瘤、糖尿病、严重肝、肾疾病，尿毒症者；近期内服用抗凝药、抗血小板药、激素、免疫抑制剂者。

1.2研究方法

收集所有研究对象的一般资料。清晨6点至8点抽取肘静脉血7ml，其中5ml以乙二胺四乙酸抗凝，应用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；另外2ml以枸橼酸钠抗凝，生化法测定血浆Fg浓度。按照傅毅等[7]研究设计引物，上游引物P1:AGA,ATA,GGG,TAT,GAA,TTT,GTT,ATT；下游引物P2:AAT,CGT,GAC,TCA,TTA,ATG,ATA,CCA。PCR反应体系见表1。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒→52℃退火45秒→72℃延伸60秒，共35个循环；最后72℃延伸7分钟。应用限制性内切酶HaeIII对FGB-455G/A扩增产物进行酶切，标准琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，凝胶成像观察酶切产物片断以区分基因多态性。

2结果

2.1FGB-455G/A基因多态性是位于FGB基因启动子区455位点的G→A突变，其中G-455等位基因为野生基因，A-455等位基因为突变基因，故该基因多态性的三种基因型为：455GG型（野生型）、455GA型（杂合突变型）、455AA（纯合突变型）。本研究设计的引物所扩增的PCR产物大小为170bp，三种基因型能被HaeIII酶切后产生3种不同的DNA片段。通过凝胶成像显示酶切电泳图的条带类型来判定该基因多态性类型。PCR产物随机抽样经测序证实与酶切后凝胶成像判定的结果相符（图1）。

2.2由实验得到的LEDVT组和对照组FGB-455G/A基因型频率及构成比（表2），应用χ2检验分析两组之间FGB-455G/A基因型频率构成比是否存在差异。经计算：χ2＝16.861，P＜0.05，差异有统计学意义，可认为FGB-455G/A三种基因型在两组之间的分布频率不同。

2.4血浆Fg浓度在FGB-455G/A各基因型之间的比较：455AA+AG型3.82±1.32（g/L），455GG型3.29±0.97（g/L），P<0.05，两组之间的差异有统计学意义。

2.5应用多元二项Logistic回归方程筛选各临床参数变量，Fg进入最后方程，OR=1.718；455AA+AG基因型进入最后方程，OR＝1.739。该结果提示：Fg浓度、455AA+AG基因型可能是LEDVT发病的独立危险因素。

3讨论

纤维蛋白原是凝血系统的核心蛋白质，Fg在血浆中的水平受到遗传、环境等众多因素的共同作用[8],双胞胎研究（atwinstudy）表明遗传因素在血浆Fg总变异中的作用大约占40％～50％[9，10]。在本研究中，LEDVT组的Fg浓度明显高于对照组，提示Fg浓度升高与LEDVT有关；经多因素logistic回归后Fg进入最后的方程，提示在调整其他因素的影响后Fg浓度升高的人群患LEDVT的风险是Fg浓度正常者的1.718倍，血浆Fg浓度升高可能是血栓形成性疾病的独立危险因子。

FGB-455G/A基因多态性位于FGB基因上游启动子区,它是由455位点G→A发生突变所致。众多学者针对该基因多态性进行研究：Green等在分析了心肌梗塞患者和健康人的β-455G/A基因多态性后，首次得出A-455等位基因与血浆Fg浓度升高相关；deMaat等[11]发现A/A基因型的患者冠状动脉粥样硬化的进展很快，推测该基因型通过增高血浆Fg浓度而导致冠状动脉疾病的进展；Tybjaerg-Hansen等[12]的大样本研究提示A等位基因者血浆Fg浓度升高，但A等位基因与IHD之间无相关性。本研究对FGB-455G/A基因突变型和野生型的血浆Fg浓度进行了比较，结果提示A-455等位基因与Fg浓度升高相关，该结论与国内外相关研究结果相近。而关于A等位基因升高Fg浓度的分子机制目前已有相关研究结论：Brown等[13]首先应用电泳迁移率检测（Electrophoreticmobilityshiftassays，EMSAs）的手段，发现有3种复合物能特异性地与Fgβ链启动子-468～-439区域的DNA片断相结合，其中分子量约47Kd的复合物III能优先地与FGB-455的G等位基因结合而减慢下游的FGB基因转录，从而抑制FGB链的合成，使循环中的Fg含量减少，若G等位基因突变成A等位基因，这种对FGB链合成的抑制作用被破坏，循环中的Fg含量就会增加。他们又应用分子克隆手段，将FGB455位点不同碱基的DNA片段克隆到pGL2载体，再转染到肝癌细胞株HepG2细胞上，通过测定荧光酶活性比较不同分子的表达，该实验有利地阐明了A等位基因与FGB转录水平升高有关的机制，因此携带A-455等位基因或携带455AA+AG基因型的人群有高Fg浓度的风险。真核生物的转录水平受到顺式作用元件和反式作用因子的调控，启动子作为与转录因子相结合、决定基因转录水平的重要顺式作用元件，其功能和活性改变通常能引起表达产物的变化。结合本研究结果，位于启动子区的基因多态性通常能通过影响转录水平而改变相应血浆产物的浓度。

本研究结果显示:455AA+AG型在LEDVT组的分布频率高；A-455等位基因在LEDVT组的分布频率高；多因素Logistic回归分析中455AA+AG基因型进入最后的方程，本研究结果提示：FGB-455G/A基因多态性与LEDVT相关，455AA+AG基因型携带者患LEDVT的风险增加，而A-455等位基因可能是LEDVT的遗传危险因素。由于A-455等位基因与血浆Fg浓度升高相关，所以推测A-455等位基因可能通过升高血浆Fg浓度而导致LEDVT的发生。

通过本研究可以对LEDVT的临床防治提出以下建议：1.FGB-455G/A基因多态性检测可能会成为LEDVT一级预防的有效手段。2.携带A-455等位基因者，或携带455AA+AG基因型者LEDVT的易感性较高，应该加强针对LEDVT的预防保健工作。3.Fg浓度高于正常的人群应当使用药物或非药物的手段降低Fg浓度，达到预防和治疗LEDVT的目的。

（图A：黑箭头指示处呈单峰A碱基，该基因多态性为AA型；

图B：黑箭头指示处呈单峰G碱基，该基因多态性为GG型；

图C：黑箭头指示处呈双峰A/G碱基，该基因多态性为GA型）

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