IL-6R与IgAN牛津病理分型的相关性分析＊

叶菲，张磊，王宇，韩昌松，金晓明，金承俊△

哈尔滨医科大学病理教研室（哈尔滨，150086）

武警黑龙江省总队医院内二科（哈尔滨，150076）

哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科（哈尔滨，150001）

△通讯作者：金承俊

＊本课题为黑龙江省卫生厅科研课题（课题编号2007-458,2012-526）

【摘要】目的：本研究拟从炎性因子IL-6R在IgAN患者血清和肾活检组织的表达，结合IgAN的牛津分型，探讨对IgAN临床诊断及预后评估有价值的标记物。方法：采用免疫荧光技术和ELISA法，对164例原发性IgAN患者的血清和肾活检冰冻切片进行了IL-6R指标的检测。结果：164例IgAN患者肾活检组织中IL-6R在在牛津分型M0组表达比M1组高（P<0.05）。IL-6R在E0组表达比E1组高（P<0.05）。血清IL-6R正常对照组和IgAN患者组间无差异（P>0.05）。结论：IL-6R在IgAN的系膜增生和毛细血管内增殖方面起重要作用。

关键词：IgA肾病；白介素-6受体；牛津病理分型

IgA肾病（IgANephropathy,IgAN）是目前世界范围内最为常见的一种原发性肾小球疾病[1]。本机构是中国北部地区肾活检诊断中心，根据肾活检诊断记录，IgAN是最多见的，其发病率高达24.7%。白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)与白细胞介素6受体(IL-6R)结合可活化系膜细胞，使免疫/化学介质产物和氧自由基增加，从而导致血尿、蛋白尿和肾脏病变进展[2]。本研究对IgAN患者血清和肾活检组织进行了IL-6R的检测，并结合最新的牛津病理分型来分析，探讨对IgAN临床诊断及预后评估有价值的标记物。

材料与方法：

1.研究人群

164例冰冻切片组织是从2005年到2008年在哈尔滨医科大学病理教研室经肾活检确诊的IgAN患者中随机选出，用于检测肾组织中IL-6R的表达。其中男90例、女88例，男女比约1:1，平均年龄30.9±10.66岁。选取同一时期确诊为微小病变性肾小球肾炎10例切片作为对照。53例IgAN患者血清，来自内蒙古中医学院附属医院，经本教研室专家重新确诊分级，用于ELISA检测。男性24例，女性28例，平均32.15±9.92岁。26例对照组血清是从哈尔滨医科大学附属第二医院体检中心获取，男7例，女19例，平均年龄27.64±10.22岁。

2.牛津病理分型

按照IgAN的牛津病理分型标准对所有肾活检病例分型[3,4]，根据系膜细胞增生程度分为M0与M1型（系膜评分≤0.5为M0，系膜评分>0.5为M1），根据毛细血管内增殖程度分为E0与El型（不存在增生为E0，存在增生为El），根据肾小球节段硬化或黏连程度分为S0和Sl型（不存在为S0，存在为Sl）。

3.主要试剂

IL-6R多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），人IL-6RELISA试剂盒（R&D公司，上海朗顿生物技术有限公司分装），FITC标记羊抗兔IgG（北京中杉金桥有限公司）。

4.免疫荧光检测

PBS工作液浸片10min，山羊血清室温封闭孵育20min，一抗（IL-6为1:50，IL-6R为1:50）室温孵育5h，PBS工作液洗3次（3×3min），二抗1:150室温避光孵育2h，PBS工作液洗3次（3×3min），滴加30µl甘油（1:10）封片，荧光显微镜下观察。

5.ELISA检测

空腹抽取静脉血4ml，室温放置，当血液凝固后，血液回缩有上清析出时，以3000r/min速度离心10min。血IL-6R的检测采用双抗体夹心ELISA法，具体操作按说明书进行。

6.结果判定

按照在不同的倍率下的表达情况，结合荧光强度和占肾小球表达的面积进行分级，见表1。

7.统计学分析

计量资料以均数±标准差表示。采用非参数H检验。计数资料采用例数或百分构成比表示，采用χ2检验。多组资料用Kruskal-WallisTest检验。用SAS13.0软件进行分析。

结果：

1.肾活检组织中IL-6R的表达

免疫荧光检测结果：IL-6R的表达在IgAN的肾小球沿基底膜呈点状或线状的表达（图1），在对照组的冰冻切片内无表达（图2）。

Fig.1TheexpressionofIL-6Rispositive（×200）Fig.2Theresultofcontrolisnegative（×200）.

2.IL-6R表达与牛津分型的关系

IL-6R表达与牛津分型的关系，见表2。IL-6R在系膜细胞增生M0组与M1组之间比较差异具有统计学意义，P<0.05。IL-6R在毛细血管内增殖E0组与E1组之间比较，差异具有统计学意义，P<0.05。IL-6R在节段硬化或黏连S0组与S1组之间比较无显著性差异，P>0.05。

3.IL-6R的ELSIA检测结果

血清IL-6RELISA检测结果在IgAN患者组与健康对照组比较无显著性差异（P>0.05），如图3所示。

讨论：

IgAN是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，是导致终末期肾病的主要病因之一。而肾脏病变的类型和程度是决定疾病诊断、治疗及预后的重要因素。lgAN病理分型有很多种，但至今没有世界公认的分型。国际协作组织在2009年公布了IgAN的牛津病理分型。然而牛津分型的研究基础所包含的265例IgAN患者中来自中国的患者仅有28例，欧洲和北美的IgAN患者占绝大多数的比例。但是在流行病学统计分析中，亚洲国家的原发性肾小球肾炎有40%-50%为IgAN。因此在我国lgAN患者中验证牛津分型具有十分重要的临床应用价值和现实性。

IL-6作为炎症因子在lgAN中很早就被研究[5,6]。IL-6可以由病变肾脏局部系膜细胞分泌，同时IL-6又可以作为系膜细胞的一个自分泌因子，刺激系膜细胞增生和系膜基质分泌[7]。研究表明在体外实验中IL-6可以使系膜细胞活化，并随着浓度的增加表现为细胞体积增大、细胞数量增多、胞质空泡变、IL-6mRNA表达增加、分泌更多的炎症介质如血小板活化因子、氧自由基和血栓素B2等。这些因素均表明IL-6可引起系膜细胞增生和炎症介质及氧自由基的增加[8]。从而导致临床上出现蛋白尿、血尿和肾脏硬化、纤维化。这与我们课题组之前在金葡菌细胞膜20肽致IgAN小鼠模型[9]的研究结果是一致的。而IL-6发挥作用的机制是IL-6必须与IL-6受体形成复合物。此复合物为IL-6、IL-6、gp130构成的六聚体，可引起信号传导，从而发挥IL-6的生物学作用。本实验结果显示，IL-6R在牛津分型M0组表达比M1组高，IL-6R在E0组表达比在E1组高。证明IL-6R与系膜细胞增生和毛细血管内皮细胞增生关系密切。而系膜细胞增生和毛细血管内皮细胞增生提示肾小球病变具有组织学活动性,则为判断肾功能衰竭的速度和对免疫抑制剂治疗敏感性的最有价值的病理学指标。因此IL-6R可作为监测IgAN组织学活动性的指标之一。

本实验检测IL-6R血清学指标结果显示，血IL-6R水平在IgAN患者组与健康对照组之间无显著性差异。这可能与血清IL-6R反映的是血液循环中的致炎因子的量，而IL-6R作为一种炎症因子可能因为其他因素而受到影响。例如体外病原体进入机体或者体内的一些其他致炎因子的刺激也有可能导致血清里的IL-6R水平增高，所以患者组和对照组可能没有显著性的差异。因此本研究认为IgAN患者检测血清中IL-6R的临床意义不大。

参考文献：

1.SuzukiK,HondaK,TanabeK,etal.IncidenceoflatentmesangialIgAdepositioninrenalallograftdonorsinJapan.KidenyInt,2003,63:2286-2294

2．ChenWP,ChenA,LinCY.Invitroeffectsofinterleukinsonhumanmesangialcells:implicationsforglomerulonephritis.JPathol.1995;175(3):175-327.

3．WorkingGroupoftheInternationalIgANephropathyNetworkandtheRenalPathologySociety.TheOxfordclassificationofIgAnephropathy:rationale，clinicopathologicalcorrelations，andclassification.KidneyInt.2009;76:534-545.

4．WorkingGroupoftheInternationalIgANephropathyNetworkandtheRenalPathologySociety.TheOxfordclassificationofIgAnephropathy:Pathologydefinitions,correlations，andreproducibility.KidneyInt.2009;76:546-556.

5．HoriiY,MuraguchiA,IwanoM,MatsudaT,HirayamaT,YamadaH,FujiiY,DohiK,IshikawaH,OhmotoY.InvolvementofIL-6inmesangialproliferativeglomerulonephritis.JImmunol.1998;143:3949-3954.

6．RuefC，BuddekK，LacyJ,NorthemannW,BaumannM,SterzelRB,ColemanDL.Interleukin6isanautocrinegrowthfactorformesangialcells.KidneyInt.1990;38(2):249-257.

7．RuefC,BuddekK,LacyJ,NorthemannW,BaumannM,SterzelRB,ColemanDL.lnterleukin6isanautocrinegrowthfactorforMesangialCells.KidneyInt.1990;38(2):249.

8．BartosikLP,LajoieG,SugarL，CattranDC.PredictingprogressioninIgAnephropathy.AmJKidneyDis.2001;38:728-735.

9.ZhangL,YeF,HeY,KongD,HanC,ZhaoZ,ZhuJ,MengH,LiuX,JinX.EstablishmentofamouseIgAnephropathymodelwiththeMBP-20-peptidefusionprotein.AnatRec(Hoboken).2010;293(10):1729-37.