金胆片中槲皮素、山奈素含量的质量分析

金华郝立芳袁晓芳

金华郝立芳袁晓芳（淮安药品检验所江苏淮安223300）

【中图分类号】R282.5【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2011）27-0080-03

【摘要】目的建立定量测定金胆片中槲皮素、山奈素含量的HPLC法，分析151批金胆片质量，为金胆片质量标准的统一、完善提供依据。方法色谱柱：AgilentC18柱，150mm×4.60mm，5µm；流动相：甲醇—0.4%磷酸溶液（50∶50）；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10µl。结果山柰素线性回归方程为y=5E+07x+433.78，R=1（n=6），线性范围0.5µg/ml～40µg/ml；平均加样回收率为100.30%，RSD为1.83%（n=5）；槲皮素线性回归方程为y=5E+07x-1141.1，r=0.9997（n=5），线性范围0.5µg/ml～20µg/ml平均加样回收率为99.40%，RSD为0.99%（n=5）；结论该方法简便，快速，准确，可用于测定金胆片中槲皮素、山奈素的含量。不同厂家生产的金胆片中槲皮素、山奈素含量差异较大，存在少投料甚至未投料的可能性。

【关键词】金胆片槲皮素山奈素HPLC法

金胆片由龙胆、金钱草、虎杖、猪胆膏四味组成。具有清热解毒、消炎利胆、排石作用，适用于急、慢性胆囊炎、胆石症及胆道感染，该药对于胆道疾患的主要症状腹痛有明显的缓解作用[1]。其中金钱草能促进胆道括约肌松弛，增加胆汁分泌，提高胆汁浓度，有利胆作用[2]。金钱草中重要成分为黄酮类成分[3]。本次分析涉及样品总批数为151批，涵盖10个生产企业，占全国生产企业的66.7%；涉及质量标准8个（包括1个部颁标准，7个单页标准），未控制任何黄酮类成分的含量。本文采用统一的方法对151批样品进行分析，为金胆片质量标准的统一、完善控制提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器

METTLERTOLEDOAG135型电子分析天平；Agilent1260高效液相色谱仪，DAD检测器；KH7200E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，400W，40KHz）。

1.2试药

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所；批号：100081—200907）；山奈素对照品（中国药品生物制品检定所；批号：110861—200808）；甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）；金胆片样品（151批样品均为2010年江苏省评价性抽样所抽取样品；龙胆（坚龙胆）、金钱草、虎杖、猪胆膏及辅料由江苏七O七天然制药有限公司提供。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：AgilentC18柱，150mm×4.60mm，5µm；流动相：甲醇—0.4%磷酸溶液（50∶50）；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10µl。

2.2对照品溶液的制备

精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥12小时以上的槲皮素对照品适量，加甲醇制成4µg/ml的溶液，作为对照品溶液。

精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥12小时以上的山柰素对照品适量，加甲醇制成20µg/1ml的溶液，作为对照品溶液。

2.3样品溶液的制备

取本品10片，精密称定，研细，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，补足重量，放冷，过滤，精密量取续滤液25ml，加入盐酸5ml，水浴回流1小时，立即冷却，转移至50ml量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4阴性样品溶液的制备按处方称取除金钱草药材外其他药味，按标准制法制成阴性对照。（该阴性原料由江苏七O七天然制药有限公司提供）。

2.5干扰试验取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液按2.1项下色谱条件试验，结果表明：阴性样品溶液的色谱图中在与龙胆苦苷对照品的色谱图中相同保留时间处无吸收峰，阴性无干扰。见图1。

图1HPLC色谱图

A：槲皮素对照品；B：山奈素对照品；C：样品D：阴性对照

2.6线性关系考察

2.6.1山柰素线性关系

精密称取山柰素对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液分别制成浓度为0.5µg/ml、2µg/ml、4µg/ml、10µg/ml、20µg/ml、40µg/ml的溶液，分别精密量取10µl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程为y=5E+07x+433.78，R=1，表明山柰素在0.5µg/ml～40µg/ml范围内线性关系良好。

2.6.2槲皮素线性关系

精密称取槲皮素对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液分别制成浓度为0.5µg/ml、2µg/ml、5µg/ml、10µg/ml、20µg/ml的溶液，分别精密量取10µl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程为y=5E+07x-1141.1，r=0.9997，表明槲皮素在0.5µg/ml～20µg/ml范围内线性关系良好

2.7精密度试验分别精密量取槲皮素对照品溶液和山柰素对照品溶液各10µl按2.1色谱条件注入液相色谱仪，槲皮素峰面积RSD=0.7%（n=6）；山柰素峰面积RSD=0.9%（n=6）。

2.8稳定性试验分别取槲皮素对照品溶液和山柰素对照品溶液在配制后0、0.5、1、2、4、6、8h进样，测得峰面积，结果表明两者均在8小时内稳定，槲皮素RSD为1.1%，山柰素RSD为0.7%。

2.9重复性试验取样品（批号：100524），按2.3项下的方法制备样品溶液5份，按2.1项下色谱条件试验，测得槲皮素、山奈素总量为0.154mg/片，RSD为1.6%。结果表明本法重复性良好。

2.10加样回收率试验取已知含量的供试品适量（批号：100524）分别加入槲皮素、山奈素对照品，按2.3项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件试验。结果见表1、表2。

表1槲皮素回收率测定结果

表2山奈素回收率测定结果

2.11样品的测定取样品溶液按2.1项下色谱条件试验，统计结果见表3、表4及图2。

表3不同生产厂家槲皮素、山奈素总量统计表

图2金胆片中槲皮素、山柰素总量样本分布图

十个生产厂家的槲皮素、山奈素总量差异显著，表明金钱草药材品质及投料量的差异性。部分厂家依然存在不同批次的样品含量差异较大的现象，说明企业在生产质量管理控制上存在不稳定的情况。

3讨论

3.1已有相关文献报导测定金胆片中槲皮素、山奈素的含量[4-6]。本文旨在通过考察金胆片中槲皮素、山奈素的含量分析金胆片的整体质量，故参考相关文献，选择2.1色谱条件。

3.2参考相关文献[7-8]，为考察提取的较佳条件，分别考察了不同酸浓度，水浴回流的温度和时间，比较所得的实验结果，选用2.3的实验条件进行实验。

3.3《中国药典》（2010版）金钱草项下规定：按干燥品计算，含槲皮素和山柰素的总量不得少于0.10%[9]按金胆片处方，若100%投料，每片折合金钱草药材约1.23g，龙胆药材0.12g，虎杖药材0.41g。若提取率为100%，每片含槲皮素和山柰素总量不得少于1.23mg。通过对151批样品的分析，其槲皮素和山柰素总量平均值为0.18mg/片，我们自制的样品（按处方100%投料）中，槲皮素和山柰素总量为0.21mg/片，我们自制样品所用金钱草中槲皮素和山柰素总量为0.43mg/g,由此可见，药材的品质和生产工艺是影响样品中各成分含量的重要因素，此外，制定合理的限度值亦很重要。

3.4经分析，我们认为按现行标准检验，不能有效控制产品质量，部分生产厂家存在违法违规投料的可能性。故我们建议严格按照GAP的要求，建立规范化的药材生产基地，保证药材质量的稳定、可靠；统一并提高现行质量标准，多指标控制产品质量；加强生产监管工作及市场监督，从而保证药品的质量，保障用药安全有效。

参考文献

[1]卫生部药品标准.中药成分制剂第十六册:99.

[2]陈月芳，李永金.金胆片的抗炎试验研究[J].江苏大学学报，February2003,13(1).

[3]中药大辞典.上海:上海科学技术出版社，2006.(上册):1966-1967.

[4]杨燕飞.HPLC测定金胆片中山柰素和槲皮素的含量[J].中成药,2005.27卷11期:1263～1265.

[5]丁立新，李春英，孙启芬，高效液相法测定小叶金钱草中槲皮素和山柰素的含量[J].黑龙江医药科学.2009,32（5）17～18.

[6]阎婷，金宪涵，王盈.HPLC测定金钱草中槲皮素和山柰素的含量[J].中华中医药学刊,2009，27（3）：653～654.

[7]张集盘，叶国梁等.RP—HPLC测定金钱草中槲皮素和山柰素两种黄酮成分的含量[J].江苏药学与临床研究，2005，13（1）:31～33.

[8]杜勇，李琰，张小茜.金钱草质量标准的研究[J].中国中药杂志，2006，31（5）438～440.

[9]中华人民共和国药典.2010,一部:204.