痰一步离心制片方法的研究

徐华苏旭尹万王丹璐

徐华苏旭尹万王丹璐（成都市第五人民医院病理科四川成都611130）

【摘要】目的通过改进痰制片方法，提高痰制片质量，提高病理诊断质量。方法收集本院2011年6月至2012年6月100例痰标本用一步离心法制片。结果使用一步离心涂片方法制片的质量明显优于传统涂片的方法。100例痰液标本用传统涂片方法HE染色，显微镜下观察，检出1例有癌细胞。而采用一步离心涂制片方法HE染色，显微镜下观察，检出3例有癌细胞。所有检出癌细胞的病例通过活检，组织HE制片，病理诊断均诊断为癌。结论使用一步法离心涂片制作的痰液制片质量明显优于传统涂片制片方法。

【关键词】一步法离心制片脱落细胞病理诊断HE制片

【中图分类号】R36【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）25-0017-01

近年来有关痰液标本涂片的制片方法：用挑取痰液内可疑部位标本直接涂抹在载玻片上，癌细胞检出率极低。痰液标本有较多蛋白质，使用普通液基制片方法几乎不可能成功，使用化学试剂处理后制片，细胞有受损，制片成功较低，影响病理诊断。

1材料和方法

1.1材料收集成都第五人民医院2011年6月至2012年6月痰液标本100例。痰液收集方法：早晨醒来第一次深咳痰的痰液标本收集到干净杯子内送到病理科检测。方法：痰液涂片的方法：仔细挑选痰液内带血丝或者有可疑地方标本涂抹在载玻片上。固定方法均在95%酒精内固定一小时后进行HE染色。

1.2一步离心涂片方法将同样方法收集到的痰液标本放置在专用的标本瓶内，瓶内有专用的痰液处理液和细胞固定剂。收集的标本放置30分钟后，放置在振荡器中振荡5分钟。用棉签除去上面漂浮物，放置在一步离心法制片机上进行制片，离心5分钟后，取下载玻片，制片完成。制片完成后放在95%酒精内固定30分钟后即可进行HE染色。用该方法进行制片时可根据痰液量的多少反复进行制片可提高癌细胞的检出率。

(1)HE染色方法蒸馏水：1min，苏木精液染色：5～10min，流水去苏木精液：1min，1%盐酸-酒精：1～3s，稍水洗：1～2s，返蓝（用温水或1%氨水等）：5～10s，流水冲洗：1～2min，蒸馏水洗：1～2min，0.5%伊红液染色：1～3min，蒸馏水稍洗：1～2s，80%乙醇：1～2s，95%乙醇Ⅰ：2～3min，95%乙醇Ⅱ：2～3min，无水乙醇Ⅰ：3～5min，无水乙醇Ⅱ：3～5min，石炭酸-二甲苯：3～5min，二甲苯Ⅰ：3～5min，二甲苯Ⅱ：3～5min，二甲苯Ⅲ：3～5min，中性树胶封固[1]。

(2)免疫组化染色方法：水化涂片。Tri-EDTA热修复10-20分钟。PBS冲洗，3×5分钟。加3%H2O，室温20分钟。PBS冲洗，3×5分钟。加一抗孵育1-2小时。PBS冲洗，3×5分钟。加Envision抗孵育30分钟。PBS冲洗，3×5分钟。DAB显色。水洗。复染及封片[2]。

2结果

用传统方法制片的100例痰涂片标本在显微镜下进行判读，有30例标本制片满意：镜下见到吞噬了尘粒的组织细胞，有5例见到了含铁血黄素。其中1例查见癌细胞，经活检取材HE染色制片，显微镜下病理诊断得到了确诊。用一步法离心制片100例痰液标本。在显微镜下观察进行判读，有90例标本制片满意：显微镜下见到了吞噬了尘粒的组织细胞，其中有10例见到了含铁血黄素。其中，有4例查见了癌细胞，经活检取材HE染色制片得到了确诊。10例用一步法离心制片的标本的涂片不满意是由于痰液标本取样质量不高，不是深部咳出的痰，并且痰液量较少，因此对痰液的取样质量也是重要的前提条件。

对4例查见癌细胞的阳性病例的痰液样本和选取了10例用一步离心法制片满意的痰液标本再次用一步离心法制片制作了涂片各5张，制片完成后用10%的中性福尔马林固定2小时后用于免疫组化染色：CK、EMA、lcA、CD68、Vim的染色在显微镜下进行判读。

总共14例痰液标本的一步离心法制作完成后免疫组化染色结果：14例标本涂片的吞噬尘粒的组织细胞，CD68和lcA阳性，CK和EMA阴性。在鳞状上皮细胞和柱状上皮等上皮细胞CK和EMA阳性，Vim、CD68、EMA阴性。4例HE染色查见癌细胞标本的再次用一步法离心制片完成的户涂片用免疫组化染色的癌细胞CK和EMA阳性，CD68和Vim及lcA染色阴性。免疫组化染色对于判读异型是否为癌细胞有重要意义。

3讨论

痰液内查见癌细胞是一种无损伤可反复进行的一种价格低廉的诊断肺癌的有效的方法。但该方法必须是在痰液内有癌细胞的情况下才能被检测出来。若痰液标本的采取未遵循深部咳痰的痰液的取材方法，则痰液内无癌细胞。则不可能从痰液内查找到癌细胞。若痰液中癌细胞数量较少用传统的挑选痰液标本的可疑部位进行涂片检查，漏诊的可能性极大，也无法进行免疫组化染色。运用分子病理诊断的方法。用一步法离心制片，首先对痰液标本进行细胞固定剂固定和专用试剂处理，可以在不改变细胞形态的情况下将脱落细胞从痰液中分离出来，再利用一步法离心制片进行制片。并且可以利用有限的标本反复进行制片，并且每张涂片的细胞种类和数量，分布百分比比例相似性，可以用于免疫组化染色病理诊断。显著提高了病理诊断水平，是痰液内查找癌细胞不仅限于显微镜下形态观察，也可应用分子病理诊断的方法。可提高病理诊断水平和使痰液内查找癌细胞的方法标准化。避免传统的痰液内挑选痰液涂片的人为因素误差，在显微镜下观察诊断时，运用分子病理诊断方法可使人为的形态学观察（在形态观察很容易受个人经验和个人主观意愿干扰，影响病理诊断的质量）最终形成走向标准化，建立规范的、标准的、不受人为主观意愿干扰的标准病理诊断方法。

参考文献

[1]张乃鑫.临床技术操作规范.病理学分册，2004，37-38.

[2]王伯沄，李玉松，黄高昇，李远强.病理学技术.人民卫生出版社，2000，421.