RP多糖体内抗鸭乙型肝炎病毒实验研究

何云鹏陶慧慧刘群红

何云鹏陶慧慧刘群红

（安徽理工大学医学院安徽淮南232001）

【摘要】目的观察RP多糖在体内对DHBV的抑制作用。方法体内实验以先天感染DHBV的雏鸭为动物模型，将雏鸭(10只/组)随机分为5组(RP多糖高、中、低3个剂量组、3-TC组、生理盐水对照组)，均以20mg/kg/d灌胃给药10天。给药前1天、给药后5天、10天及停药后3天，均采用斑点杂交法观察血清中DHBV-DNA表达。结果各剂量组RP多糖对DHBV均有相应的抑制作用。其中给药后第5天，高、中剂量组血清DHBV-DNA为0.77±0.27、0.69±0.15，第10天为0.57±0.11、0.49±0.19，与生理盐水对照组(1.32±0.56、1.24±0.53)相比明显降低。给药后第5天，RP多糖高、中剂量组对DHBV-DNA的抑制率为25.16%、25.35%，第10天为45.94%、48.28%，与生理盐水对照组对比显著提高。结论RP多糖可降低血DHBV-DNA含量，对DHBV有抑制作用。

【关键词】菲律宾蛤仔多糖鸭乙肝动物模型乙型肝炎

【中图分类号】R392-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）04-0041-02

ExperimentalStudyofRuditapesphilippinarumPolysaccharide

onAnti-DHBVinVivo

HeYunpengTaoHuihuiLiuQunhong

(SchoolofMedicine，AnhuiUniversityofScience＆Technology，Huainan，Anhui23200l，China)

【Abstract】Objective:Toobservethein-vivoinhibitoryeffectofRPpolysaccharideonDHBV.Methods:1-dayoldBeijingducklingswithcongenitalinfectionofDHBVwereusedastheanimalmodelandwererandomlypidedintofivegroups(Namely,RPpolysaccharidehighdosegroup,mediumdosegroup,lowdosegroup,Lamivudinegroupandnormalsalinegroup).Eachgroupofducksweregiventhedrugwiththedoses20mg/kg/dfor10days.TheexpressionofDHBV-DNAwasdetectedbydot-blothybridizationtest1daybeforetreatment,fivedaysandtendaysduringtreatment,and3daysafterdrugwithdrawal,respectively.Results:IneachgroupoftheRPpolysaccharidehascorrespondinginhibitiononDHBV.AfterbeingmedicatedwithRPpolysaccharideforfivedays,inRPpolysaccharidehighdosegroup,mediumdosegroup,SerumDHBV-DNAwas0.77±0.27,0.69±0.15;whilefortendays,0.57±0.11,0.49±0.19,respectively,whichwasobviouslylowercomparedwiththoseinnormalsalinegroup(1.28±0.54,1.20±0.5l).TheinhibitionratesofDHBV-DNAinRPpolysaccharidehighdosegroup,mediumdosegroupwere25.16%,25.35%respectively5daysaftertreatment,while45.94%,48.28%;respectively10daysaftertreatment,indicatingremarkableimprovementcomparedwiththecontrolgroup.Conclusion:RPpolysaccharidecanprotectduckliveragainstinflammationbytheinhibitionofDHBV.

【Keywords】RuditapesphilippinarumpolysaccharideDuckhepatitisBanimalmodelHepatitisB

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum,RP)，属软体动物门(Mollusca)、双壳纲（Bivalvia）、帘蛤科(Veneridae)，广泛分布在我国南北沿海的浅海区，又称杂色蛤、蛤蜊、花蛤。其生长周期短，适应能力强，经济价值高，适合人工规模养殖，系我国传统养殖的四大贝类之一。菲律宾蛤仔可作食药两用，以其入药自古就有记载:宋朝掌禹锡《嘉祐本草》中记其“润五脏，止消渴，开胃，解酒毒，主老癖能为寒热者，及妇人血块，煮食之。”《中华本草》中总结其“味甘、咸、性寒；清热解毒。主臁疮；黄水疮。”因其药用功效显著且价廉易得，被广泛作为研究对象，国内外学者近年来的研究表明，其具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力、降压、降血脂、延缓衰老等药理作用[1]。目前对其抗病毒作用的研究不多，本文尝试对RP多糖在体内抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的作用进行探讨。

1材料

1.1动物先天感染DHBV的北京雏鸭50只(1日龄，重50±5g)，购自北京昌平种鸭场。

1.2药物本实验室提取的RP多糖（将活体RP去壳、洗净后匀浆，用超声波辅助热水提取、乙醇沉淀法提取多糖，经柱层析分离纯化后即得到水溶性好、米黄色的粗提物，经谢里瓦诺夫反应、莫立许反应和菲林反应鉴定，其中含多糖成分，纯度约为82.5%[3]）。葛兰素史克制药（苏州）有限公司生产的拉米夫定（化学名2’3’-双脱氧-3’-硫代胞嘧啶，又称3-TC）。

1.3试剂缺口翻译平移试剂盒：北京普洛麦格生物技术公司；NC膜：PALL公司；SephadexG-50：Amresco公司；a-32p-dCTP：北京福瑞生物工程公司；DHBV质粒：北京普如汀生物技术公司。

1.4仪器设备96孔杂交点样器:Bio-Rad公司；P-Ⅲ、H-Ⅲ显微摄影系统:Nikon公司；盖革氏计数器:S.EInternational公司；恒温振荡器:Bio-Rad公司；高速冷冻离心机:Eppendorf；酶联免疫检测仪：上海华东电子管厂；数显恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；超低温冰箱:SANYO公司。

2方法

2.1动物模型1日龄北京雏鸭购回后，适应性喂养2天，于4日龄经胫静脉采血，离心后收集血清，用PCR法检测先天感染DHBV-DNA阳性雏鸭。将雏鸭(10只/组)随机分为5组(RP多糖高、中、低3个剂量组、3-TC组、生理盐水对照组)。

2.2药物实验采用公式LgS=0.8762+0.6981lgW（S为体表面积，单位cm2，W为体重，单位g）计算药物剂量。3-TC组给药按照60kg人服用3-TC100mg/d的剂量换算[2]。模型对照组给予生理盐水1ml/kg/d，RP多糖各剂量组、3-TC组均按20mg/kg/d，连续灌胃给药10天。在给药前1天(D0)，用药第5天(D5)，用药第10天(D10)和停药后第3天(S3)，经胫静脉采血、分离血清，-20℃冻存待检。

2.3检测方法取备检鸭血清，每批同时点膜，血清中DHBV-DNA水平用斑点杂交法检测。操作方法按缺口翻译试剂盒说明，用32P标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜斑点，在酶标检测仪上测定A值（滤光片波长490nm），以此作为标本DHBV-DNA水平值，计算血清DHBV-DNA密度。

DNA抑制率公式：

抑制率（﹪）=给药前A值-给药后A值×100﹪

给药前A值

2.4数据处理实验数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS11.5软件包进行统计分析，治疗前后比较采用配对t检验。

3结果

表1药物（RP多糖）对DHBV-DNA的抑制作用（x-±s，A490）

组别鸭数

（只）A490值

D0D5D10S3

药物高剂量组101.01±0.400.77±0.271）0.57±0.111）0.70±0.12

药物中剂量组100.91±0.050.69±0.151）0.49±0.191）0.72±0.03

药物低剂量组100.76±0.120.72±0.080.62±0.150.81±0.23

3-ＴＣ组101.06±0.060.94±0.081）0.52±0.192）0.93±0.06

模型对照组101.36±0.231.32±0.561.24±0.531.51±0.62

注：与给药前比较。1）P<0.05，2）P<0.01（配对t检验）

表2各组雏鸭不同时段DHBV-DNA的抑制率的比较（﹪）

组别鸭数

（只）抑制率（﹪）

D5D10S3

药物高剂量组1025.161）45.941）31.72

药物中剂量组1025.351）48.282）21.72

药物低剂量组105.7018.527.12

3-ＴＣ组1011.9953.012）12.99

模型对照组103.129.3612.62

注：与对照组比较。3）P<0.05，4）P<0.01（成组t检验）

4讨论

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种常见多发的感染性疾病，其以肝脏炎性病变为主，持续感染可导致肝硬化、肝癌等肝脏疾病[4]。国家卫生计生委2013年7月公布的数据显示：我国乙肝病毒携带者近1亿人，每年新发感染者约10万人，每年约35万人死于病毒性肝炎及相关肝病。乙肝及相关疾病不仅给社会带来了沉重的负担，更严重威胁着我国人民的健康。目前乙肝治疗尚无特效药，在药物治疗中主要以抗病毒、免疫调节和护肝药物为主[5]。经美国FDA批准用于慢性乙型肝炎治疗的抗病毒药物有干扰素、拉米夫定、阿德福韦、替比夫定和恩替卡韦，但这几种药物的疗效均有一定局限性，因此不断研究开发疗效显著、治愈率高、毒副反应较少且不反弹的新型抗病毒药物是今后的发展方向[6]。

抗乙肝病毒药物动物模型常用的有鸭、土拔鼠、黑猩猩，及近年研究的转基因小鼠及移植人肝组织的小鼠模型等[7]。灵长类动物(黑猩猩、长臂猿等)属珍贵动物，受伦理及费用等方面的限制，难以推广应用。土拨鼠主要分布在美洲，国内来源少，不作为首选。鸭(如北京鸭、重庆麻鸭等)是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的自然宿主，先天性或幼年感染的雏鸭可发展成持续性DHBV感染[8]，是目前普遍使用的动物模型。

本实验用北京麻鸭作为动物模型进行体内抗乙型肝炎病毒的研究。实验结果显示，阳性对照组(3-TC)每天持续按20mg/kg的剂量灌胃，用药期间鸭血清的DHBV-DNA滴度明显降低，但停药后3天，病毒很快重新复制，出现反跳现象。在给药后5天、10天，RP多糖高、中剂量组与给药前及对照组比较，鸭血清的DHBV-DNA水平都降低(1）P<0.05，2）P<0.01)，低剂量组抑制作用不明显，结果见表1。给药后第5天，RP多糖的高、中剂量组对DHBV-DNA的抑制率为25.16%、25.35%，第10天为45.94%、48.28%，与生理盐水对照组对比显著提高(3）P<0.05,4）P<0.01)，结果见表2。综上所述RP多糖有明显抑制乙肝病毒作用，降低血清DHBV-DNA含量。RP多糖有望成为治疗乙型病毒性肝炎的新药，有进一步研究的价值。

参考文献

[1]陶慧慧，何云鹏，刘群红.菲律宾蛤仔药用价值的研究进展[J].中外健康文摘，2011,8（3）:70-72.

[2]袁伯俊．新药临床前安全性评价与实践[M]．北京．军事医学科学院出版社，1997，48．

[3]陶慧慧.菲律宾蛤仔多糖的优化提取及体外抗HBV作用研究[D]．安徽：安徽理工大学,2011．

[4]陈志强，董俊兴．抗乙型肝炎病毒药物研究进展[J]．中国药学杂志，2000，(35)：435-437.

[5]刘红洽，廖俊艳．乙型肝炎的药物治疗[J]．临床合理用药，2011，4（1）：159－160．

[6]赵丽红，任玉新．抗乙肝病毒药物的研究进展[J]．医学理论与实践，2008，21（10）：

[7]张亚兰，袁维峰，史利军．抗乙型肝炎病毒药物评价用实验动物模型现状[J]．生物技术通讯，2011，22（1）：127－129．

[8]梁亮，李瑗．乙型肝炎相关动物模型的研究进展[J]．中国人兽共患病杂志，2005，21(3)：259-261.