自动化定量检测梅毒的研究进展

(整期优先)网络出版时间:2016-12-22
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自动化定量检测梅毒的研究进展

张建军

绍兴市妇幼保健院浙江312000

摘要:梅毒是由梅毒密螺旋体感染引起的。传统检测梅毒的方法需要熟练的技术员操作和解释结果。最近的研究显示,自动化定量检测梅毒的方法正成为研究热点,将逐渐替代手工法,而自动化RPR检测特别适合于疗效监测。

关键词:梅毒;密螺旋体实验;乳胶凝集;RPR

目前,在临床实验室常用的梅毒检测方法一般需手工进行,肉眼或显微镜观察结果,容易误判,而且不能准确定量,很难量化疗效。国外已开始研究自动化检测梅毒的方法,自动化定量检测必将成为梅毒检测的发展趋势。另一方面,我国梅毒感染呈上升趋势【1-2】,甚至胎传梅毒感染也呈逐年上升趋势【3】,不仅关系到病人本身,还关系到我国出生人口素质,因此,需要尽快提高梅毒的检测手段,早期诊断,早期治疗,更好为临床服务。

下面,本文就近年来自动化定量检测梅毒的研究进展做一综述。

一、传统梅毒检测方法----梅毒抗体检测【4】

(一)、特异性抗体检测。

梅毒螺旋体的重要致病因子包括12种膜蛋白和几种溶血素,当人体感染梅毒螺旋体后,大约经过3周的潜伏期,在入侵部位出现硬下疳,然后5-15天后可在血清中检测出梅毒特异性抗体。目前常用的有梅毒密螺旋体血凝试验(TPHA),梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA),酶联免疫吸附试验(ELISA),梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS),胶体金法,梅毒抗体蛋白印记法(Western-blot,WB)。

检查特异性抗体的试验目标是在临床进行确诊,该类检测能很好诊断各期梅毒,结果稳定可靠,但价格相对较高且耗时长。其缺点是不适于大批量的筛选试验,无法对梅毒的疗效及预后进行判断,也无法确定梅毒是否已被治愈和再感染。

(二)、梅毒非特异性类脂质抗体检测。

梅毒非特异类脂质抗体为梅毒螺旋体侵犯及损伤组织所产生,出现较晚,一般在硬下疳出现4周才能检出,在梅毒早期患者经充分治疗后滴度可逐渐下降直至完全消失,当病情复发或再感染后可由阴性转阳或滴度逐渐上升。目前常用的方法有:性病研究实验室试验(VDRL),血清不需加热的反应素试验(USR),快速血浆反应素环状卡片实验(RPR)和甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)。

此类试验价格便宜、手工进行,其中RPR是观察治疗效果、复发、或再感染的重要指标。但此类试验要由肉眼或显微镜观察结果,其缺点是费人费时费力,不适合有大批量标本的血站医院筛查;而且实验人为影响因素较多,容易误判;由于不能准确定量,很难量化疗效。

二、自动化检测梅毒的发展方向。

(一)、PCR(Polymerasechainreaction-basedtests,聚合酶链反应试验)。

用PCR方法检测梅毒的研究是从90年代就开始了【5】,但是费时费力,一直没有在临床得到推广。2013年,Gayet-AgeronA[6]系统分析了从1990年1月至2011年1月间用PCR方法诊断梅毒的报道,发现用PCR方法特异性好,但是灵敏度只有中等,对结果的影响因素很多,包括:一、不同的标本,会有不同的检出率。其中在初发梅毒的溃疡物中,PCR法检出率最高。PCR对血液中梅毒的检测不是很理想,血清和血浆中梅毒的检出率要高于全血中的检出率;二、选择的目标基因不同,如有的实验室选择tpp47,而有的则选择polAgene,因而检出率也不同。;三、选择的PCR方法不同,如巢式PCR(NestedPCR)、实时定量PCR检测(real-timepolymerasechainreaction)、多重PCR(MultiplexPCR)等,检出率也不同。

2012年,GrangePA[7]结合临床表现,血清学检测,DEM(dark-fieldmicroscopy,暗视野显微镜),巢式PCR(扩增tpp47基因)等手段检测梅毒,发现用PCR检测拭子标本,其灵敏度达82%,特异性达95%,与DFM结果的吻合率为0.53,但是血标本的PCR结果并不好,在外周血单核细胞,血浆,血清,全血中的灵敏度分别只有29%,18%,14.7%,24%。

总体说来,用PCR方法检测溃疡物和硬下疳,还是较好的方法。

(二)、自动化免疫法检测血清抗体。

SaralY[8]等人比较了用CMIA(ChemiluminescenceMicroparticleEnzymeImmunoassay,化学发光酶免疫检测),RPR及TPHA三种方法检测117位梅毒患者的结果,发现和TPHA相比,RPR与CMIA的灵敏度分别是58%vs98%,特异性是0%vs100%,说明自动化的酶联免疫系统可以减少诊断错误。

但是OzbekOA[9]用CMIA法检测了2007年1月至2010年二月间12195份血清标本,如果CMIA阳性,就用RPR和TPHA重测,研究发现,如果RPR滴度大于≥1/32,CMIA的S/CO值大于21;当CMIA的S/CO值大于12时,其结果与TPHA和RPR的符合率是100%,但当S/CO值小于12,只有19.1%的CMIA阳性与TPHA相符,说明低值的CMIA并不能准确判断阳性结果。

2010年-2013年,相继有学者报道利用[10-12]一种新的化学发光免疫法chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)检测梅毒。CLIA法是一步夹心法,特异性梅毒抗原(TpN15,TpN17,TpN47)包被在板上,病人血清和异氨基苯二酰肼-抗原结合物一起混合孵育一小时,经过清洗和加发光底物后进行检测。作者报道,与TPPA相比,其特异性为99.9%,敏感度为100%,且对于原发梅毒,其诊断敏感度要高于TPPA,因而在不久的将来,手工TPPA法被自动化的CLIA法取代可能会成为趋势。

也有学者【13-14】报道用其他自动化方法如GICA(Goldimmunochromatographyassay)等方法检测梅毒抗体,认为其灵敏度和特异性均达到FTA-ABS法,可以取代传统的FTA-ABS法。

(三)、自动化免疫浊度实验。

1、RPR的自动化检测。

RPR试验,又称快速血浆反应素环状卡片实验,是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇颗粒混合并加入活性碳组成的复合物为抗原,能快速简便地测定梅毒患者血清中的非特异性抗体,结果容易判断。梅毒在人体内感染活动的程度基本与RPR定量试验成正比例,当梅毒经过治疗,感染全部控制后,RPR转为阴性,当梅毒复发后,再感染则其定量实验的滴度相应增高。因此,RPR是观察治疗效果、复发、或再感染的重要指标。在临床中也是做为初筛最普遍使用的实验。对其实现自动化定量操作,一直是研究者关注的热点。

NohJ[15]评估了Mediace,一种日本生产的可在生化仪上使用的RPR自动化试剂,检测了8个初次感染,7个二次感染,35个潜伏感染的病人,74个RPR、TPHA已确诊阳性的病人,108个献血者,并与FTA-ABS法,传统的RPR实验,TPHA实验进行比较,发现Mediace有较高的假阳性率。

2009年,KimYS[16]比较了两种RPR自动化试剂:MediaceRPR(日本)及HBiAutoRPR(韩国),与手工法的结果比较,并用WB法做确诊,发现两种自动化试剂与手工法的符合率分别只有83.8%和83.2%,在RPR滴度为1:16时,MediaceRPR还有前带现象,R.U值与RPR滴度也不成线性。因此,认为现有的商业试剂不能很好地替代手工法,需进一步改进。

2014年,日本学者【17】对68名梅毒患者,其中包括57名HIV病人进行了为期两年的观察,同时用手工法和机器法进行RPR检测,发现自动法可以替代手工法进行HIV阳性或HIV-阴性伴梅毒病人的检测,尤其是在治疗阶段。

但总体而言,RPR自动化试剂仍需进一步改进。

2、自动化TPPA试验

ChoiSJ等人[18-19]近年来使用HiSensAutoRPR和AutoTPPA,同样是胶乳浊度试验,并可以进行定量检测,所有样品均由临床自动生化仪自动检测,其中RPR以比值小于1.0为阴性,TPPA以抗体浓度小于10U/mL为阴性,VDRL和FTA-ABS为手工操作,研究发现,自动化RPR试验和VDRL相比,符合率为67.5%。而自动化TPPA与FTA-ABS的符合率高达96.4%,自动化RPR试验有高的特异性,但敏感度不如VDRL,而自动化的TPPA试验灵敏度和特异性都达到了98.0%。因而建议用自动化RPR和TPPA在临床上取代常规的梅毒检测试验。

由于自动化检测的出现,学者们甚至提出了反向检测梅毒策略【20】,即以自动化检测梅毒抗体做为初筛,RPR试验做为疾病程度和治疗效果的观察指标,虽然这种说法目前还有争议,但是自动化定量检测梅毒已成为一种发展趋势。

参考文献:

[1]TuckerJD,YinYP,WangB,etal.AnexpandingsyphilisepidemicinChina:epidemiology,behaviouralriskandcontrolstrategieswithafocusonlow-tierfemalesexworkersandmenwhohavesexwithmen.SexTransminfect2011,87:ii16-ii18

[2]MuessiqKE,CohenMS.Editorialcommentary:China,HIV,andsyphilisamongmenwhohavesexwithmen:anurgentcalltoaction.ClinInfectDis,2013,57(2):310-313

[3]张建军,曾艳,张秀兰等。苍白密螺旋体及RCH母婴垂直传播的研究。中华医院感染学杂志,2011,13:2667-2668

[4]李丹,崔巍,高伟。血清中梅毒抗体检测的研究进展。内蒙古医学杂志,2010,42(3):321-324

[5]BurstainJM,GrimprelE,LukehartSA,etal.SensitivedetectionofTreponemapalliidumbyusingthepolymerasechainreaction.JClinMicrobiol,1991:29;62-69

[6]Gayet–AgeronA,LautenschlagerS,NinetB,etal.Sensitivity,specityandlikelihoodratiosofPCRinthediagnosisofsyphilis:asystematicreviewandmeta-analysis.SexTransmInfect,2013,89(3):251-256

[7]GrangePA,GressierL,DionPL,etal.EvaluationofaPCRtestfordetectionoftrponemapalliduminswabsandblood.JClinMicrobiol,2012,50(3):546-552

[8]SaralY,DilekAR,DilekN,etal.Serologicdiagnosisofsyphilis:comparisonofdifferentdiagnosticmethods.ActaDermatovenerolcroat,2012;20(2):84-8

作者简介:张建军,1971年12月出生,男,汉族,主任技师,研究方向:性传播疾病梅毒的母婴传播与梅毒脂质抗体的研制

基金项目名称:定量检测梅毒脂质抗体的试剂的研制

绍兴市一般科技项目---公益性技术应用研究计划

基金编号:2012B70061