毛冬青甲素对K562红白血病细胞survivin和bax蛋白的影响

赵早云朱惠斌席建元江劲波周欣欣

赵早云朱惠斌席建元江劲波周欣欣（湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙410007）

【摘要】目的：观察毛冬青甲素对K562红白血病细胞survivin和bax蛋白的影响。方法：采用流式细胞术（FCM）检测毛冬青甲素对K562细胞survivin蛋白和bax蛋白表达水平。结果：不同浓度毛冬青甲素处理K562细胞48h后，流式细胞仪分析结果显示bax蛋白表达升高，与对照组比较差异具有显著性（P＜0.01）；而survivin蛋白表达下降，与对照组比较差异具有显著性（P＜0.01）。结论：毛冬青甲素可抑制survivin上调，促进bax的表达。

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）03-0142-01

毛冬青系毛冬青科植物，微苦、甘、平、归心经，含多种黄酮、酚、甾醇、氨基酸、糖、鞣质、三萜等成分，毛冬青甲素（IA）是从毛冬青中分离出的一种活性成分，分子式为C34H48O6Na,研究发现IA（10-5mol∕L）对心肌钙离子内流具有明显促进作用（P﹤0.05）[1]。其所具有的正性肌力作用可能由于药物加快了细胞钙的转运率所致[2]。IA可抑制血小板激活时的钙内流，与钙慢通道拮抗药VER非常类似[3]，同时通过对102例鼻咽癌患者临床对照试验，毛冬青注射液对组织淋巴结消失的平均放疗剂量明显低于对照组，增敏比达1.54，提示IA的钙通道阻滞及放疗有增敏功能[4]。本文以红白血病K562细胞为研究对象，探讨毛冬青甲素诱导红白血病细胞K562凋亡过程中对survivin和bax基因蛋白表达的影响，从而为红白血病的预防和治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1细胞培养

K562细胞株购自上海雅洁公司，培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的PRMI-1640培养基中，置37℃，饱和湿度5%的CO2培养箱中培养，2～3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2试剂及仪器

毛冬青甲素由广东省博罗先锋药业集团有限公司提供（批号111201）。Survivin(71G4B7)(Alexa)488conjuateRabbitmAb购于cellsignaling公司（批号#2810s）。Bax(2D2)AF647购于santacruz公司（批号sc-20067）。PureLinkTM购于ambion公司（批号Catno.12183018A）。RNAmimikit购于ambion公司（批号（lotno.987201）。RNA提取试剂盒由invitrogen公司提供，RP-PCR试剂盒由invitrogen公司提供。流式细胞仪购自BD公司的FACSCaLibur，PCRABI公司的2720，琼脂糖凝胶电泳仪购自北京北信未来电子科技中心，型号：DL21-SH-2040

1.3实验方法

取对数生长期K562细胞，分别加入0、0.2、0.4g/ml的毛冬青甲素处理48h后弃培养液，收集细胞。细胞置于4%的多聚甲醛37℃固定10min，冰上冷却1min。90%甲醇冰上孵育30min，含0.5%BSA1×PBS洗涤细胞2次，AlexaFluor®488标记的兔抗人survivin抗体(CST,#2810)和AlexaFluor®647标记的bax(santacruz,#20067)抗体室温孵育1h，0.5%BSA1×PBS洗涤1次，空白对照只加入细胞。流式细胞仪测定，每管计数10000个细胞。流式细胞仪测定细胞阳性率，细胞阳性率变化表示各蛋白处理前后的表达变化情况，阳性率(%)=实验组细胞的阳性率-空白对照组细胞的阳性率。

2FCM检测survivin和bax蛋白表达的结果

毛冬青甲素处K562细胞48h后，流式细胞仪分析结果显示bax蛋白表达升高，与对照组比较差异具有显著性（P＜0.01）；而survivin蛋白表达下降，与对照组比较差异具有显著性（P＜0.01），见表1。

毛冬青甲素作用于K562细胞48h后survivin蛋白和bax蛋白表达的变化（x-±s，n=4）

分组荧光指数

survivinbax

对照组（g/ml）39.81±2.7215.12±0.75

毛冬青甲素组0.125.70±1.36*21.92±1.49*

毛冬青甲素组0.24.72±1.93*39.47±1.06*

*：与对照组比较，P＜0.01。

3讨论

白血病是造血干细胞克隆性疾病，是一组高度异质性的恶性血液病，不但是细胞增殖和细胞分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病，细胞凋亡受基因调控，国内外研究已证实survivin是凋亡抑制蛋白，广泛表达于人类各种肿瘤，具有抑制细胞凋亡、参与细胞周期调节的功能，Bax是一种凋亡促进蛋白，具有促进细胞凋亡的作用[5-6]。在前期的临床和基础实验研究中发现毛冬青甲素（IA）具有清热解毒、抗菌消炎作用、对脑血栓、心肌梗死、脉管炎等具有良好的疗效，是一种肯定了的钙离子通道阻滞剂，能有效增强、逆转白血病细胞的多药耐药。本试验以毛冬青甲素作用于红白血病K562细胞，流式细胞仪检测发现随着药物浓度的增长，survivin在红白血病K562细胞中表达下调，bax在红白血病K562细胞中表达上调，表明毛冬青甲素能影响红白血病K562细胞凋亡，有关其确切机制，有待进一步探讨。

参考文献

[1]贾可亮，罗荣敬，邱卓嶷等。毛冬青甲素对兔心肌钙离子内流的影响，广州中医学院学报，1992,8（1）：14.

[2]贾可亮，陈芝喜，邱卓嶷等。毛冬青甲素对离体兔心血管环核苷核水平的影响，广州中医学院学报，1992,9（2）：79.

[3]王玲.毛冬青甲素对血小板激活时钙流动的影响[J].中西医结合杂志，1989,9（11）：668.

[4]吴少雄，张恩罴，吴伟宏。毛冬青(IP)作为鼻咽癌放射增效剂的临床观察[J].癌症，1992,11（1）：56.

[5]FuldaS,DebatinKM.Sensitizationfortumornecrosisfactor-relatedapoptosis-iducingligand-inducedapoptosisbythechemopreventiveagentresveratrol[J].CancerRes,2004,64(1):337-346.

[6]FuldaS,DebatinKM.Resveratrol-mediatedsensitizationtoTRAIL-inducedapoptosisdependsondeathreceptorandmitochondrialsignaling[J].FurJCancer,2005,41(5):786-798.