组织工程化人工骨构建的细胞实验

曲志强刘海霞陈微微兰荫梧魏东岩刘思佳

曲志强刘海霞陈微微兰荫梧魏东岩刘思佳

（内蒙古通辽市医院骨三科内蒙古通辽028000）

【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）03-0377-02

组织工程的完成，必须具备三个基本条件：①种子细胞的筛选和体外分离培养；②支架材料；③种子细胞与支架材料、生长因子复合构建组织工程化组织。本实验在前期工作中已成功地从体外分离培养出了骨髓基质细胞，作为种子细胞。

1实验材料及细胞培养

1.1材料

1.1.1主要设备及仪器

FormaCO2培养箱，超净工作台，OLMPUS倒置相差显微镜，37℃水浴恒温震荡器，电子天平，酶连免疫检测仪，电热鼓风干燥器，蒸馏器，荧光显微镜，图像分析系统，扫描电镜。

1.1.2主要试剂

培养基DMEM，胎牛血清,Ficoll淋巴细胞分离液，PBS缓冲液，地塞米松、β－甘油磷酸钠、维生素C、四环素盐酸盐，青霉素，链霉素，胰蛋白酶及L-谷氨酰胺，碱性磷酸酶试剂盒等。

1.1.3实验动物

健康成年新西兰家兔五月-六月龄，购买于广东省实验动物中心,体重2.5kg-5kg。

1.2骨髓基质细胞的原代培养

取两月龄的新西兰大白兔，雌雄不限，3％戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉（30mg／Kg），用8%硫化钠将双侧股骨大转子部位褪毛后，常规消毒，铺无菌洞巾，无菌条件下自左右两侧股骨大转子上部用18号穿刺针各抽取骨髓3ml，与36ml含体积分数10%胎牛血清(FBS)和青霉素及链霉素(Hyclone,美国)的α-MEM培养基(Gibco-Brl,美国)混匀,接种于100mm培养皿,每皿10ml,置于37°C、体积分数5%的CO2培养箱中孵育。倒置相差显微镜下逐日观察。3d后半量换液,1周后完全换液。以后每周更换培养液两次培养至12d时,贴壁细胞近90%汇合,吸净培养基,以PBS冲洗两遍,每皿加入1.5ml质量浓度为0.5g/L的胰蛋白酶(含0.2g/LEDTA),置培养箱孵育5min。

1.3骨髓基质细胞的传代培养

原代细胞培养3d后半量换液,1周后完全换液,以后每周更换培养液两次，培养至10～12d，倒置相差显微镜下观察细胞接近融合为单层（贴壁细胞约占培养瓶底80％）后，吸净培养基,以PBS冲洗两遍,每皿加入1.5ml0.25％胰蛋白酶对原代细胞进行消化2～3分钟，显微镜下观察见到细胞核开始回缩，细胞已开始变形后，立即加入9ml含有血清的培养液终止消化。并用吸管对培养瓶底的细胞进行反复吹打，使之逐渐脱壁，制成单细胞悬液后，加入新的培养液按1∶1比例接种于新的培养瓶进行第一次传代。仍置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。24h后加入条件培养液（原培养液中加入β-甘油磷酸钠10mmol／L，地塞米松10-8mol／L，抗坏血酸50μg／L）。每3d换液一次，相差显微镜下逐日观察。传代成功后约5～6d传代细胞接近融合为单层，再按上述方法消化传代进行下代细胞培养。共传至第3代，加人PBS和含有血清的培养液终止消化并吹打成单细胞悬液，备用。

1.4骨髓基质细胞的形态学观察

在倒置相差显微镜下逐日观察细胞生长、增殖及形态特征的变化。

1.5碱性磷酸酶染色

更换培养液12d后将各组爬满细胞的盖玻片取出，采用钙钴法测定。

钙钴法的主要理论根据是利用β－甘油磷酸钠为底物，用Ca2＋和Co2＋捕获磷酸，再用硫化铵处理可形成硫化钴或硫化铅黑色终产物，沉淀在细胞所表达的部位就呈现出明显的黑色。因此阳性染色为黑色。染色后光镜下，每组任取一张染色盖玻片，在10×物镜下，任计500个细胞计算阳性率；同时每组取6个标本，各组每一染色标本在10×物镜下随机选取5个视野，每一视野用Image－ProPlus图像分析系统测量染色区域的总面积值和平均光密度值，然后求它们的乘积，5个视野的平均值就代表这一染色标本的染色阳性均值。

1.6骨髓基质细胞培养

接种后36～48h,细胞开始贴壁,培养5d,低倍镜下可见多个细胞积聚成团;8d细胞进一步贴壁生长,细胞成纺锤状及不规则三角形,有长短不同的突起。此后细胞进入迅速增殖,直至10d,细胞贴壁于整个培养瓶,细胞相互融合,达70%～80%的融合率,胞体渐增大,传代后细胞增殖进一步加快,传至第3代,培养3d即可见细胞单层融合。

1.7碱性磷酸酶染色

诱导对照组碱性磷酸酶染色阳性率为72.4％，均以胞质内染色阳性为主，为灰黑色颗粒和块状沉淀，有的甚至掩盖了整个细胞，在细胞聚集处阳性细胞数多。空白对照组阳性染色偶见，复染后观察才明显，阳性率仅为3.6％。Image－ProPlus图像分析显示诱导对照组与空白对照组碱性磷酸酶染色阳性总面积和平均光密度值的乘积（平均值）有极显著性差异（P<0.001）。

参考文献

[1]单玉兴,刘一,徐莘香.兔骨髓间质干细胞用于构建组织工程软骨组织的初步报告.中国修复重建外科杂志,2001,15(1):49-52.

[2]刘劲松,曾才铭,王宏邦,等.骨髓基质细胞培养和体外成骨研究.中国修复重建外科杂志,1997,11(4):237-241.