酶联免疫吸附试验检测的影响因素分析

钱瑞

钱瑞（山丹县人民医院734100)

【摘要】目的通过对酶联免疫吸附试验检测的影响因素分析，探讨各因素对结果的影响，以便寻找解决的方法和加强质量控制，从而保证检测结果的准确性和精确性。

【关键词】酶联免疫吸附试验影响因素分析

【中图分类号】R446.61【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）41-0059-02

酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测生物标本中微量的特异性抗体或抗原的临床检验方法，而且其反应中各组分的成本较为底廉，特别是对肝炎病毒的检测，最基层的医院也能开展。因其操作简单，灵敏度高，特异性好，经济安全，不需要特殊设备等特点而在临床上广泛应用。为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。在从事检验工作多年中深知ELISA测定中影响因素较多，由于其操作步骤复杂，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，甚至出现错误的结果，因此，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。现将影响因素做以分析。

1材料

1.1试剂的准备

目各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。应选择质量优良、有批准文号且在有效期内的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作。从冰箱中取出的试剂应放在室温下或37℃平衡30分钟再进行测试。保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并做好记录，冰箱应避免频繁开关,试剂使用前应摇匀。

1.2标本的准备

酶联免疫吸附实验中标本的质量也是影响结果的关键因素之一，标本的干扰物质容易引起假阳性或假阴性的结果。

1.2.1严格执行样本的查对制度，接受标本应将标本上的标签与申请单逐一核对，验收签字。对科室自采的标本，接到申请单后，按申请单上的姓名将受检者喊应，确定性别、年龄、，然后编号抽血，避免标本采集错误。

1.2.2抽血时，应尽量避免溶血，对于重度溶血标本应重新采血进行测定。因标本溶血红细胞破坏溶解时释放出大量血红蛋白，血红蛋白中的亚铁血红素具有过氧化物酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA试验测定中，可能会增加非特异性显色而出现假阳性结果，对于严重脂血，黄疸及药物治疗等影响检测结果的标本，应叮嘱受检者适时重新检测。

1.2.3标本在低温下保存时间不宜过长。通常血清标本可在2~8℃保存，如样品在7天内不测定，需将血清或血浆和血细胞分离后，置—20℃保存。冷冻保存标本避免反复冻融，标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，是抗体效价下降从而引起假阴性结果。

1.2.4血清标本应充分离心，彻底去除纤维蛋白，否则可因残留的纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。

1.2.5标本污染生化与免疫标本的混用，可能造成免疫检测标本的污染。其原因是免疫指标是定性检测，标本在检测生化试验时极微量的交叉污染都可能造成免疫测定结果的不准确。此外，全自动酶免疫分析仪的加样针或加样吸头清洗力度不够，造成阳性标本和其他标本的污染。

2方法

2.1加样

加样应严格按照试剂盒说明书中所规定的量和顺序进行，加样时应将标本加在微孔反应板底部，避免加在孔壁上部，注意不可溅出，不能产生气泡，如不慎将标本或试剂溅出孔外时，应用吸水纸轻试吸干，加标本一般采用手工加样或者加样器。手工加样每次必须换吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在实际操作中揣摩使用技巧，避免吸样量过多或过少。加标本一般采用手工加样或者加样器。手工加样每次必须换吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在实际操作中揣摩使用技巧，避免吸样量过多或过少。加样器在长时间使用时会因机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因此必须定期对加样器进行维护和校准。手工操作时，微孔反应板加样后应及时温育，标本加样较多时应分批操作，以免加样后温育前等待时间过长。

2.2温育ELISA反应是抗原、抗体的结合在固相表面上发生的一系列的反应，抗原抗体结合是一个逐步平衡的过程，需要经过扩散才能达到反应的终点，因此ELISA反应需要一定时间的温育。温育也是影响检测结果的关键因素，尤其是对弱阳性标本影响最为明显，温育时严格按试剂盒操作说明书控制温育时间，不能人为延长或缩短温育时间，反应时间要准确，时间过短，特异性结合不够，易产生假阴性；时间过长，非特异性结合物紧附于反应孔，难以洗脱，测定值偏高，37℃是实验室中最常用的温育温度，温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即“边缘效应”）可将ELISA板置于水浴箱中，温育时微孔反应板不要叠加，要加封贴封纸，这样可以防止孔内液体成分蒸发或水珠等杂质滴入孔内影响检测结果，封片不能重复使用。

2.3洗涤洗涤虽然不是一个反应步骤，但也影响实验的成败，其目的是去除反应体系中与反应无关的成分，包括未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，一般认为洗板机比手工洗板效果要好。洗板机设置时间、间隔、次数要保持一致，不能过多或过少。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果；洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果。洗板时注意各种试剂盒的洗液不能混用，且试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应按规定的倍数稀释。洗涤要彻底，以去除实验中未参与的所有物质，加入洗涤液时，应防止在反应孔中形成气泡而造成洗涤不充分，也不可冲力过大，以防包被在固相载体表面的成分脱落而造成假阴性。酶结合物不耐干燥，特别在较高的温度下更易失活，加入底物前，甩干的反应板在空气中暴露的时间长短也会影响实验结果，所以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不能马虎，否则前功尽弃。

2.4显色与比色

操作时应注意各试剂盒显色剂不能混用，不能使用过期显色剂，添加顺序不能颠倒，不能溅出孔外。ELISA显色结果必须通过酶标仪进行检测，不可由肉眼判断结果，因为不同个体的色觉存在差异，这样可减少实验误差，提高临界值样本的分析准确度。加终止时应避免产生气泡，加入终止液后应尽快比色，否则样本吸光度值会逐渐下降，显色越深下降越快，应在二分钟内比色。酶标仪应采用双波长进行测定，这样可排除单波长测定时的测定干扰。

2.5结果的判读

酶标仪读数时应保证微孔反应板底部清洁，严格按照试剂盒说明书的规定进行读数和结果判读,严格依据试剂盒提供的阳性判定值进行结果判定，厂商提供试剂的同时，说明书上列出的CO值是建立在一系列科学试验及统计研究的基础上，不能随意更改。通常情况下ELISA报告方式为阴性或阳性，在二者之间有一条明确的分解线，即阳性判定值CO值，对于样本的吸光度值（A）高于CO值就判断为阳性，相反则判断为阴性。然而在实际工作中经常会出现A值位于CO值附近的样本，即ELISA检测的灰区，在ELISA试剂盒中均未涉及到灰区的设置，对可疑标本可进行复检或结合其他方法如金标法等手段进一步确诊。

3做好室内质控与室间质评

要保证检验结果的准确可靠，必须做好室内质控，在每批试验中除了试剂盒附带的阴阳性对照外，还要选择一个为弱阳性的室内质控品，如发现失控及时查找原因，定期对各项检测的均值、变异系数等进行比对分析。室间质评是控制实验室结果的准确性，是一种回顾性评价，要保证同标本一样对待室间质评物，这样可以找出原因，改进工作中的不足。

4讨论

综上所述，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，尽管ELISA法操作简单，但影响测定结果的因素也很多。世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易”，故在实际操作的过程中，要加强质量控制，认真做好室内质量控制与室间质量评价，首先要保证实验室的环境、仪器设备与硬件设施必须处于良好的状态，其次要对试剂及测定方法过程进行标准化，另外实验室技术人员必须经过良好的培训，必须加强业务学习，不断更新知识，通过参加室间质评活动，找出原因，改进工作中的不足，认真避免或减少影响因素，熟练掌握基本操作技能，对每个环节进行严格仔细的核查，尽量避免假阳性和假阴性反应的出现，力求结果准确，为疾病的诊断提供可靠的依据。

参考文献

[1]陈云钰.ELISA法检测HIV抗体需注意的影响因素[J].中国卫生检验杂志，2011，21（6）：1564-1565.

[2]彭黎明，王兰兰.检验医学自动化及临床应用[M].北京：人民为生出版社，2003:553

[3]王传新，王国礼.现代检验医学技术及质量控制[M].山东科学技术出版社2004;32-33

[4]贺智英，陈美霓，田红英论影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法[J].中国医药导报，2008,5（22）：175-176

[5]刘祖勇.增加洗板次数对HBSAGELISA检测影响[J].中国输血杂志，2006,19（2）:135-136

[6]徐锡霞，邓巍.温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响.实用肝病杂志，2005，8(1)：16-18.