β-雌二醇对雌激素受体阳性甲状腺乳头状癌细胞CyclinD1的影响

何其勇国麟祺夏伟滨曲义坤刘伟新

何其勇国麟祺夏伟滨曲义坤刘伟新(佳木斯大学附属第一医院普外二科黑龙江佳木斯154003)

【摘要】目的：探讨β-雌二醇(β-E2)对雌激素受体（ER）阳性的甲状腺乳头状癌（PTC）细胞中CyclinD1表达的影响。方法：采用原代细胞培养获得PTC细胞，以10-8mol/Lβ-E2作用，分别应用RT-PCR法及Western-bolt法测定CyclinD1的表达。结果：β-E2可使PTC细胞中CyclinD1表达增高（P<0.05）。结论：β-E2可促使PTC细胞中CyclinD1表达增高。

【关键词】β-雌二醇;雌激素受体；甲状腺乳头状癌细胞

【中图分类号】R581【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0031-02

CyclinD1在细胞中的过表达和错误调控均可导致细胞周期调控异常，从而发生肿瘤[1]，据文献报道，PTC细胞中ER及CyclinD1阳性率明显高于正常甲状腺组织[2]，本研究立足于E2-ER通路考虑E2可能通过于ER结合，介导某些直接、间接机制促进CyclinD1过度表达，从而促进甲状腺癌发生、发展。对此进行初步探讨。

1方法

1.1甲状腺癌细胞培养：标本取自临床，肿块离体后即刻切取所需标本。冰冻切片证实为甲状腺乳头状癌，手术后标本经石蜡切片证实。标本在手术切取后30min内剪切后消化60-90min，吹打成细胞悬液。过滤，离心，种植后孵育，生长融合至80-90%时进行传代。平均5-7d传代一次，至第三、四代用于实验。

1.2RT-PCR测定ERαmRNA：灭活相关器具RNA酶，并将所有器具高压灭菌，将培养的甲状腺癌细胞离心后得到细胞沉淀。经振荡移出上层水相，再次离心，取出管底沉淀，离心后加入无RNA酶水溶解。经分光光度计检测RNA纯度与含量。将已合成的引物严格按照步骤进行逆转录反应，然后经PCR反应后，以凝胶图像分析系统进行琼脂糖凝胶电泳，将测定后ERmRNA阳性的甲状腺癌细胞归类进行下步实验。

1.3RT-PCR测定甲状腺癌细胞CyclinDlmRNA表达：将实验细胞分成对照组及实验组，分别应用事先合成的引物进行PCR实验，并将电泳产物用成像系统扫描并分析。

1.4Western-blot法测定CyclinD1蛋白的表达：实验分组同前，并严格按照步骤对两组进行Western-blot实验，并将所得结果保存。

1.5统计学处理：采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差别有统计学意义。

2结果

2.1甲状腺癌原代细胞培养：甲状腺癌原代细胞生长情况良好，用胶原酶和胰酶消化后无明显杂细胞如成纤维细胞等。

2.2ER表达:RT-PCR的方法进行ERα定性测定，12例甲状腺乳头状癌中8例ERαmRNA表达增强

2.3RT-PCR法测定CyclinD1mRNA结果:RT-PCR实验可见于200bp处，雌二醇组CyclinD1表达开始增高，应用光密度分析仪计算雌二醇组CyclinD1mRNA与β-actinmRNA光密度（A）比值，与对照组比较有所升高（P<0.05），结果显示雌二醇组CyclinD1mRNA的表达水平明显升高，并于8h开始接近高峰，8h和12h升高情况明显高于2h和4h。

2.4Western-bolt法测定CyclinD1结果:Western-blot实验可见两组在β-actin表达一致的条件下雌二醇组与对照组相比表达增强，应用光密度分析仪计算雌二醇组CyclinD1与β-actin光密度（A）比值，与对照组比较有升高（P<0.05），结果显示雌二醇组CyclinD1的表达水平明显升高。从而验证了RT-PCR结果。

3讨论

临床上甲状腺肿瘤男女发病率约为1∶4[3]，有研究表明这种现象是由于甲状腺-卵巢-垂体关联系统所决定[4]，近年来，随着ER在多种肿瘤组织中相继检出，甲状腺癌和性激素受体内在联系引人注目[5]。多项研究均提示了雌激素在甲状腺肿瘤的发生中起着相当的作用[6]。而在甲状腺癌组织中检测到ER的蛋白和mRNA进一步支持这样的理论。

CyclinD1被证实是原癌基因，其过表达和错误调控均可导致细胞周期调控异常，从而发生肿瘤，同样CyclinD1过度表达亦可促进甲状腺癌细胞的增值[7]。

本实验中以β-E2刺激PTC细胞后，通过其特有的途径可使细胞内CyclinD1表达升高，根据CyclinD1的作用机制，我们认为β-E2可起到促进PTC细胞增值的作用，力求为今后PTC的治疗中开辟新的途径。

参考文献

[1]WangS,LioydRV,HutzlerMJ,etalTheroleofcellcycleregulatoryprotein,cyclinD1intheprogressionofthyroidcancer[J].ModPathol,2000,13(8):882-887

[2]程维刚等，雌激素受体和细胞增殖周期调控蛋白D1在分化型甲状腺癌中的表达及意义《中国癌症杂志》2005，15（2）：123-129

[3]吴在德、吴肇汉。外科学（第七版），2008，296

[4]武华，李正中等.甲状腺癌组织雌激素和孕激素受体的检测，山西医学院学报，1995；26（3）；199-200

[5]BurM,ShirakiW,MasoodS.Estrogenandproggesteronereceptordetectioninneoplasticandnon-neoplasticthyroidtissues.ModPathol,1993;6(3):104

[6]ManoleD,SchildknehtB,GosnellB.etal.Estrogenpromotesgrowthofhumanthyroidtumorcellsbydifferentmolecularmechanisms.JClinEndocrinolMetab.2001:86(3):1071-1077

[7]NilssonS，MakelaS，TreuterE，etal.Meehanismsofestrogenaction.Physiolrev.2001;81(4):1535-1565